楊 婷，廖美德，劉偲嘉，賀玉廣，吳杰良

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

麩皮是小麥面粉廠的主要加工副產(chǎn)品，是重要的飼料原料[1]。用麩皮直接飼喂畜禽，其蛋白質(zhì)的利用率不高，吸收率約為30%；膨化后飼喂，吸收率＞90%。麩皮水解液中含有五碳糖和六碳糖，能被酵母菌代謝利用，用此水解液培養(yǎng)酵母可獲得優(yōu)質(zhì)飼料蛋白質(zhì)[2]。但近年來(lái)小麥種植面積持續(xù)下降，麩皮價(jià)格不斷上漲，成為制約其應(yīng)用的重要因素[3]。

木薯渣不僅含有多種氨基酸和對(duì)動(dòng)物體有益的維生素，而且產(chǎn)量豐富，價(jià)格低廉，作為新型飼料資源受到眾多科研人員的重視，并取得一定的階段性成果[4-7]。但木薯渣在飼料應(yīng)用方面存在著不易貯存、蛋白質(zhì)含量低和適口性差等弊端，限制其應(yīng)用[8-9]。接種微生物，發(fā)酵木薯渣，利用微生物與相關(guān)化學(xué)物質(zhì)發(fā)生的一系列復(fù)雜生物化學(xué)作用，可改變木薯渣的物理化學(xué)性質(zhì)，從而解決上述弊端[10-11]。此外，發(fā)酵過(guò)程中還能殺死大部分有害微生物，如腸道寄生蟲等。同時(shí)，還可以提高粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的消化率，促進(jìn)與細(xì)胞壁結(jié)合的礦物質(zhì)吸收；提高小腸絨毛的完整性，促進(jìn)小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[12]。

本研究利用優(yōu)良的黑曲霉和釀酒酵母復(fù)配制成混合菌劑，通過(guò)微生物固體發(fā)酵工藝，探索最佳生料發(fā)酵條件，提高木薯渣蛋白質(zhì)含量，改善適口性，為木薯渣的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

木薯渣為廣畜動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)地為廣西。

菌株來(lái)源：釀酒酵母和黑曲霉，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏。

改良察氏培養(yǎng)基：土豆浸出液5%、蔗糖3%、硫酸鎂0.5%、氯化鉀0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、硝酸鈉或硫酸銨0.4%。

酵母菌種子培養(yǎng)基1號(hào)：PDA液體培養(yǎng)基，一級(jí)種子培養(yǎng)基分裝到試管，二級(jí)種子培養(yǎng)基分裝到三角瓶。

酵母菌種子培養(yǎng)基2號(hào)：YPG液體培養(yǎng)基，含酵母浸粉0.5%、蛋白胨1.0%、葡萄糖2.0%，一級(jí)種子培養(yǎng)基分裝到試管，二級(jí)種子培養(yǎng)基分裝到三角瓶。

黑曲霉固體種子培養(yǎng)基：麩皮∶木薯渣∶水=1∶1∶1混合均勻。

所有培養(yǎng)基在“熟料”試驗(yàn)時(shí)，115℃下蒸汽滅菌30min，待冷卻后備用；“生料”試驗(yàn)時(shí)，不做濕熱滅菌處理，原料混合均勻即可接種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌種子培養(yǎng)基篩選

選用PDA培養(yǎng)基和YPG培養(yǎng)基作為供試種子培養(yǎng)基，控制接種量均為一個(gè)單菌落，28℃下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算酵母菌細(xì)胞濃度。

1.2.2 氮源和不同初始水分選擇

選取硝酸鈉和硫酸銨作為供試氮源，添加量為0.4%，通過(guò)液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（氮源0.4%+酵母菌1.5%+YPG培養(yǎng)基）和固體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[發(fā)酵底物為（木薯渣∶水=1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8）+氮源0.4%+酵母菌1.5%]，試驗(yàn)用同一規(guī)格三角瓶進(jìn)行，混合均勻后置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定時(shí)觀察生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)。

1.2.3 混菌發(fā)酵接種時(shí)間

木薯渣與水（70%）混合均勻后置于500mL三角瓶中，高壓滅菌（115℃，20min）后備用。先加入黑曲霉孢子懸浮液（2.5%），再設(shè)置4組間隔時(shí)間（1組 0 h、2組 12 h、3組 24 h和4組36 h）加入酵母菌（2.5%），混合均勻后置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定時(shí)觀察生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)。

1.2.4 氮源添加量的篩選

木薯渣培養(yǎng)基中硫酸銨的濃度共設(shè)置4個(gè)梯度（1組5%、2組10%、3組15%和4組20%），同時(shí)接入黑曲霉和酵母孢子懸浮液2.5%，混合均勻后置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定時(shí)觀察生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)。

1.2.5 磷酸鹽和糖蜜對(duì)木薯渣發(fā)酵的影響

設(shè)置兩組對(duì)立試驗(yàn)，分別為添加磷酸鹽（0.2%）或糖蜜（2%）組，對(duì)照組為不添加磷酸鹽或糖蜜，其他培養(yǎng)條件不變，定時(shí)觀察生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)。

1.2.6 黑曲霉固體種子的可行性

采取薄布包裹的擴(kuò)大培養(yǎng)方式，定量稱取培養(yǎng)好的黑曲霉固體種子（10%），混合均勻，其他培養(yǎng)條件不變，觀察生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌種子培養(yǎng)基

不同培養(yǎng)基對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，YPG培養(yǎng)基中的酵母菌濃度比PDA培養(yǎng)基的高88%。同時(shí)，配制YPG時(shí)只需將3種試劑按比例添加混合均勻即可，操作比PDA的配制更為便捷，因此應(yīng)選擇YPG培養(yǎng)基作為酵母菌種子培養(yǎng)基。此外，酵母菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約在培養(yǎng)12 h時(shí)出現(xiàn)，24 h后其自溶現(xiàn)象比較明顯，應(yīng)在種子培養(yǎng)12～24 h內(nèi)轉(zhuǎn)接到下一級(jí)培養(yǎng)，保證種子的濃度和活力。

2.2 氮源的選擇

2.2.1 液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

不同氮源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響見圖2。

圖2 不同氮源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

采用改良察氏培養(yǎng)基，選取硝酸鈉和硫酸銨作為供試氮源，添加量各為0.4%，28℃下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h，測(cè)定吸光度（OD600nm）。發(fā)現(xiàn)在液體培養(yǎng)試驗(yàn)中，添加硫酸銨組的OD值比添加硝酸鈉的高，說(shuō)明硫酸銨更能促進(jìn)液體培養(yǎng)中酵母菌的生長(zhǎng)。

2.2.2 固體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

不同氮源在不同初始水分下對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響見圖3。

圖3 不同氮源在不同初始水分下對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

由圖3可知，以木薯渣為底物固體培養(yǎng)酵母菌，對(duì)比兩種氮源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響。其中，硝酸鈉和硫酸銨的添加量均為3%，不同初始水分下培養(yǎng)48 h，血球板計(jì)數(shù)表明，不同水分梯度下兩組的酵母菌濃度相當(dāng)，差異不顯著（P＞0.05）。因此，硝酸鈉和硫酸銨在固體培養(yǎng)中對(duì)酵母菌生長(zhǎng)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

結(jié)果表明，雖然固體培養(yǎng)中氮源的影響差異不顯著（P＞0.05），但硫酸銨在培養(yǎng)基中很快解離為NH4+和SO42-，其中NH4+能直接被酵母菌等微生物吸收利用，SO42-能降低培養(yǎng)基的pH，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，并且硝酸鈉的價(jià)格高于硫酸銨，所以硫酸銨更適宜作為木薯渣發(fā)酵的氮源。此外，從上述固體培養(yǎng)試驗(yàn)可知，原料水分為70%，經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)后，酵母菌細(xì)胞濃度最高。

2.3 混菌發(fā)酵接種時(shí)間

不同間隔時(shí)間接入酵母菌對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響見圖4。

圖4 不同間隔時(shí)間接入酵母菌對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

黑曲霉能產(chǎn)淀粉酶，將木薯渣中的多糖分解為還原糖，能較好地為酵母菌利用，同時(shí)黑曲霉能產(chǎn)酸降低pH，正好也是適合酵母菌生長(zhǎng)的pH范圍。考慮到黑曲霉合成相關(guān)酶系需要時(shí)間，需探究延長(zhǎng)接種酵母菌的必要性?；炀l(fā)酵，1組（0 h）、2組（12 h）、3組（24 h）、4組（36 h）分別表示在接入黑曲霉后，間隔0、12、24和36 h再接入酵母菌，培養(yǎng)期間，每12 h取樣一次檢測(cè)酵母菌細(xì)胞濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時(shí)接入黑曲霉和酵母菌的混菌發(fā)酵方式更有利于酵母菌生長(zhǎng)，同時(shí)也能簡(jiǎn)化接種操作。

相對(duì)于單菌發(fā)酵，混菌發(fā)酵能促進(jìn)酵母菌的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為酵母菌細(xì)胞濃度較前者提高約20%，原因在于黑曲霉能產(chǎn)生相關(guān)酶系，降解淀粉和粗纖維含量。但在本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了另一問題，到培養(yǎng)后期時(shí)，各組酵母菌數(shù)量均有不同程度的下降。由于在三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，木薯渣培養(yǎng)基水分變化不大，對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果影響不大。其原因是黑曲霉在生長(zhǎng)過(guò)程中逐漸生成孢子，抑制了酵母菌的生長(zhǎng)?？蛇m當(dāng)調(diào)整兩者的接種量，以最適接種比例發(fā)酵，同時(shí)在培養(yǎng)過(guò)程中，多翻動(dòng)培養(yǎng)基，打斷黑曲霉菌絲，延緩孢子生成。

2.4 氮源添加量

不同濃度的硫酸銨對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響見圖5。

微生物生長(zhǎng)需要充足的氮源。氮源的配比主要影響發(fā)酵底物對(duì)礦質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)及其理化性質(zhì)。但是氮源濃度過(guò)低，合成不了足量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；氮源濃度過(guò)高，即使不影響菌株生長(zhǎng)，也會(huì)因產(chǎn)品中的殘氮量過(guò)多降低養(yǎng)殖效果，并造成原料浪費(fèi)。以硫酸銨為氮源，設(shè)置4個(gè)濃度梯度，即1組（5%）、2組（10%）、3組（15%）、4組（20%）。每隔12h測(cè)定酵母菌個(gè)數(shù)并觀察其生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4組的酵母菌生長(zhǎng)曲線均呈先上升、后下降、最后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，拐點(diǎn)出現(xiàn)在36 h，此時(shí)黑曲霉菌絲生長(zhǎng)旺盛。在培養(yǎng)后期，黑曲霉孢子的形成導(dǎo)致酵母菌數(shù)量下降后趨于平穩(wěn)。

圖5 不同濃度的硫酸銨對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

總體而言，當(dāng)硫酸銨的添加量為5%時(shí)，酵母菌生長(zhǎng)情況最佳，同時(shí)黑曲霉長(zhǎng)勢(shì)也較好?？紤]到最終發(fā)酵目的是使真蛋白質(zhì)含量＞15%，原料中必須添加足夠量的無(wú)機(jī)氮源。按硫酸銨含氮量為21.21%，蛋白質(zhì)平均含氮量為16%計(jì)算，要達(dá)到這個(gè)指標(biāo)，木薯渣培養(yǎng)基中至少添加硫酸銨13%。綜合考慮，硫酸銨添加量最終定為15%。

2.5 磷酸鹽

磷酸鹽的添加對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響見圖6。

圖6 磷酸鹽的添加對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

磷酸鹽提供金屬離子的同時(shí)，又可以對(duì)發(fā)酵底物起緩沖作用，對(duì)pH的影響很大。因此，選取磷酸二氫鈉作為供試磷酸鹽，設(shè)置對(duì)比試驗(yàn)，即1組（無(wú)磷酸鹽）和2組（磷酸鹽0.5%），每隔24 h對(duì)酵母菌計(jì)數(shù)并觀察生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽的添加對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)影響不大，但能促進(jìn)黑曲霉的生長(zhǎng)。黑曲霉有更好的長(zhǎng)勢(shì)，意味著相關(guān)酶的產(chǎn)出會(huì)更多，能進(jìn)一步改良木薯渣的性質(zhì)，因此，發(fā)酵過(guò)程應(yīng)添加磷酸二氫鈉，添加量初步定為0.5%。

2.6 糖蜜

糖蜜對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響見圖7。

圖7 糖蜜對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

糖蜜含有大量可發(fā)酵糖（主要是蔗糖），可用作酵母、味精、有機(jī)酸等發(fā)酵制品的底物或基料。試驗(yàn)設(shè)置兩組，即1組（無(wú)糖蜜）、2組（糖蜜2%）每隔24 h對(duì)酵母菌計(jì)數(shù)并觀察生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖蜜在木薯渣混菌發(fā)酵中的作用是加快酵母菌生長(zhǎng)速度但不增加其數(shù)量，同時(shí)對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)無(wú)顯著的促進(jìn)作用（P＞0.05）。

2.7 黑曲霉固體種子的可行性

接入黑曲霉固體種子對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響見圖8。

圖8 接入黑曲霉固體種子對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種黑曲霉液體種子比較難控制接種量。為保證黑曲霉種子在木薯渣發(fā)酵培養(yǎng)基中能保持活力，并便于控制其接種量，應(yīng)探究接種固體黑曲霉固體種子的可行性。采取薄布包裹的擴(kuò)大培養(yǎng)方式，定量稱取黑曲霉固體種子。觀察生長(zhǎng)期并定時(shí)計(jì)數(shù)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酵母菌的生長(zhǎng)情況比在三角瓶中好，是因?yàn)閿U(kuò)大培養(yǎng)后通氣量增加，有利于酵母菌有氧呼吸，促進(jìn)其增殖。培養(yǎng)到48和60 h時(shí)出現(xiàn)肉眼可見的白色菌絲和黑色孢子，說(shuō)明接種黑曲霉固體種子是可行的。

3 討論

木薯渣發(fā)酵降解之后微生物含量和蛋白質(zhì)含量增加，增加的蛋白質(zhì)可能是淀粉酶和纖維素酶的一些細(xì)胞外分泌物，或者是細(xì)菌/真菌復(fù)合形成的單細(xì)胞蛋白質(zhì)[13-14]。另外，降解可使氰化物含量下降，而營(yíng)養(yǎng)成分（脂肪、粗纖維、灰分、礦物質(zhì)）含量沒有變化。為了能更好的降解木薯渣粗纖維含量，提高飼料蛋白質(zhì)含量，還有很多條件可以更進(jìn)一步優(yōu)化。可嘗試用產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵，該菌種產(chǎn)蛋白質(zhì)能力比較強(qiáng)[15]。實(shí)際生產(chǎn)中不便對(duì)原料滅菌，生料中的淀粉難以被酵母菌利用，配料時(shí)可用60℃的熱水拌料，達(dá)到淀粉糊化的效果，增加培養(yǎng)基中單糖的含量，改變培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分，以利于酵母菌生長(zhǎng)[16]。黑曲霉是一種食用安全，能夠產(chǎn)生多種消化飼料的酶類，是常用的飼料復(fù)合酶產(chǎn)生菌，黑曲霉降解淀粉的能力比較強(qiáng)，但因其產(chǎn)黑色孢子，影響發(fā)酵產(chǎn)物外觀，而糖化酶對(duì)木薯渣的淀粉降解率為74.87%，可選擇工業(yè)糖化酶替代黑曲霉[17]。米曲霉的效果比黑曲霉要好，而且米曲霉所產(chǎn)的孢子偏黃綠色，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物外觀影響不大[18]。即可考慮采用“工業(yè)糖化酶+酵母菌+米曲霉”的混合培養(yǎng)方式發(fā)酵木薯渣。因此，為了不同需求可更進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝，以便將木薯渣的利用價(jià)值發(fā)揮到最大。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)采用釀酒酵母菌和黑曲霉作為發(fā)酵菌株，對(duì)開發(fā)木薯渣發(fā)酵飼料進(jìn)行了初步探究，主要內(nèi)容為探討其發(fā)酵工藝條件，確定酵母菌以液體形式接入，其種子采用液體YPG培養(yǎng)基培養(yǎng)，12～24 h后轉(zhuǎn)接到下一級(jí)培養(yǎng)；黑曲霉以固體形式接入，其種子采用麩皮-木薯渣復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)。生料發(fā)酵工藝條件為硫酸銨15%、磷酸二氫鈉0.5%、底物水分70%，同時(shí)接入酵母菌和黑曲霉，接種量均為10%。24～48 h酵母菌即能到達(dá)最高生長(zhǎng)濃度，且黑曲霉此后在60～72 h生成較多肉眼可見的黑色孢子，導(dǎo)致培養(yǎng)基整體發(fā)黑，影響其外觀，不利于做成飼料成品，因此將培養(yǎng)周期定為60 h?；炀l(fā)酵過(guò)程應(yīng)及時(shí)翻動(dòng)培養(yǎng)基，目的在于打斷菌絲以延緩黑曲霉孢子生成。

[1]林琳.小麥麩皮的營(yíng)養(yǎng)成分及其開發(fā)利用[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備，2010（3）:41-42.

[2]史建芳，胡明麗.小麥麩皮營(yíng)養(yǎng)組分及利用現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代面粉工業(yè)，2012，26（2）:25-28.

[3]申洪源.當(dāng)前我國(guó)小麥?zhǔn)袌?chǎng)行情及后市分析[J].糧食與油脂，2010（6）:35.

[4]郝靜，劉鋼，左福元.木薯渣的飼用價(jià)值及應(yīng)用[J].飼料研究，2007（11）:64-66.

[5]黃金華，王士長(zhǎng)，梁珠民，等.不同處理對(duì)木薯渣飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的比較[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40（6）:768-771.

[6]黃萍，齊仁立.木薯渣作為飼料資源的開發(fā)與利用[J].四川畜牧獸醫(yī)，2013，39（12）:34-36.

[7]艾必燕，劉長(zhǎng)忠，陳建康，等.木薯渣發(fā)酵飼料的工藝篩選[J].飼料工業(yè)，2012，33（7）:57-60.

[8]何晶.廣西木薯渣產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究[D].南寧:廣西大學(xué)，2012.

[9]賴景濤，范雪雁.木薯渣發(fā)酵的制作方法[J].中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2011，37（4）:83.

[10]賴翠華.木薯淀粉渣制取單細(xì)胞蛋白飼料的實(shí)驗(yàn)研究[D].南寧:廣西大學(xué)，2006.

[11]鐘思強(qiáng)，潘學(xué)標(biāo)，廖冬晴，等.廣西發(fā)展木薯生產(chǎn)的自然資源優(yōu)勢(shì)及對(duì)策[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39（14）:8-10.

[12]劉傳都.利用混合菌固體發(fā)酵木薯渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料的研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[13]Raman N，PothirajC.Screeningofzymomonasmobilisand saccharomyces cerevisiae strains for ethanol production from cassava waste[J].Rasayan JournalofChemistry，2008，1（3）:537-541.

[14]Oboh G，Akindahunsi A A.Biochemical changes in cassava products(flour and garri)subjected to Saccharomyces cerevisae solid media fermentation[J].Food Chemistry，2003，82（4）:599-602.

[15]葛若梅，李海燕，張惠芬，等.固態(tài)發(fā)酵木薯酒精渣生產(chǎn)生物飼料菌種的篩選[J].生物技術(shù)，2010，20（2）:82-83.

[16]陳桂光，龐宗文，梁靜娟.木薯渣生料發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的研究[J].糧食與飼料工業(yè)，1997（6）:23-24.

[17]劉琨，賴翠華，童張法.工業(yè)糖化酶固態(tài)發(fā)酵木薯渣制取單細(xì)胞蛋白飼料的研究[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào)，2007，21（4）:720-724.

[18]祝英，翟峰，蒲訓(xùn).綠色木霉、黑曲霉和米曲霉對(duì)馬鈴薯廢渣分解能力的研究[J].中國(guó)飼料，2007（23）:27-29.