王春麗，柳 偉

(1.華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200237;2.上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，tyrosinase，TYR)又稱多酚氧化酶、兒茶酚氧化酶、陳干酪酵素等，是1種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含多亞基的含銅氧化還原酶，廣泛存在于微生物、動(dòng)植物和人體中［1］。酪氨酸酶具有多種生物學(xué)功能，近年來(lái)對(duì)其在醫(yī)藥、美容、食品和環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用，引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。筆者結(jié)合近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)酪氨酸酶的研究成果，對(duì)酪氨酸酶的作用機(jī)制、提取制備以及應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述，以期為有關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)以及其深入應(yīng)用提供參考。

1 酪氨酸酶的作用機(jī)制

酪氨酸酶活性中心呈現(xiàn)出雙核銅中心結(jié)構(gòu)(圖1)，由2個(gè)銅離子位點(diǎn)組成，與蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基結(jié)合，并且由1個(gè)內(nèi)源橋基將2個(gè)銅離子聯(lián)系起來(lái)。當(dāng)酪氨酸等物質(zhì)和酶過(guò)渡絡(luò)合時(shí)，主要是羥基和酶的活性中心上的原子鍵合發(fā)生作用［2］。在黑色素的催化反應(yīng)過(guò)程中，將其分為氧化態(tài)(Eoxy)、還原態(tài)(Emet)和脫氧態(tài)(Edeoxy)3種形式［3］，區(qū)別在于雙核銅離子活性中心的結(jié)構(gòu)不同。

圖1 酪氨酸酶活性中心的雙核銅中心結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of the active center containing Cu of tyrosinase

酪氨酸酶(菌類)催化反應(yīng)具有單酚酶和雙酚酶活性，能催化氧化單酚和雙酚成為苯醌(圖2)。在單酚酶循環(huán)中，Eoxy與單酚反應(yīng)生成苯醌和Edeoxy，后者與O2結(jié)合，最終又重新生成 Eoxy。在雙酚酶循環(huán)中，Eoxy與雙酚反應(yīng)生成苯醌和Emet，后者將另一種雙酚轉(zhuǎn)化為苯醌，其自身轉(zhuǎn)化為Edeoxy形態(tài)，雙酚是Edeoxy形成的必要因素。

酪氨酸酶的單酚酶活性表現(xiàn)出特異的時(shí)滯，直到Eoxy提供足夠的雙酚。時(shí)滯長(zhǎng)短受酶的來(lái)源、單酚酶濃度等影響，濃度增大，時(shí)滯縮短，但不可完全消除，而雙酚可以完全消除時(shí)滯［4］。

圖2 酪氨酸酶的反應(yīng)機(jī)制Fig.2 Reaction mechanism of tyrosinase

酪氨酸酶催化酪氨酸氧化成多巴，多巴氧化形成多巴醌反應(yīng)，控制黑色素細(xì)胞的活性，是黑色素合成的關(guān)鍵酶(圖3)。酪氨酸酶抑制劑的濃度增大，酶活力受到抑制而使得催化效率降低。根據(jù)抑制機(jī)制的不同，將酪氨酸酶抑制劑一般分為競(jìng)爭(zhēng)型、非競(jìng)爭(zhēng)型、反競(jìng)爭(zhēng)型和混合型［5］。

圖3 酪氨酸酶催化黑色素的生物合成過(guò)程Fig.3 Process of melanin biosynthesis catalyzed by tyrosinase

2 酪氨酸酶的制備及其活性研究

迄今為止，成功分離出酪氨酸酶的生物主要有真菌(包括霉菌、食用傘菌、酵母菌等)、細(xì)菌、裸子植物、被子植物，昆蟲，脊索動(dòng)物類，哺乳動(dòng)物(包括人)［6］。但從植物中提取制備酪氨酸酶的報(bào)道較少，實(shí)驗(yàn)中以食用菌與水果為主要酶源，常見(jiàn)原料包括蘑菇、馬鈴薯和蘋果等。實(shí)驗(yàn)中所用的酪氨酸酶純酶大多為國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格昂貴且不宜大規(guī)模應(yīng)用。

研究者通常借鑒國(guó)內(nèi)外常用提取酪氨酸酶的方法，選用國(guó)內(nèi)低價(jià)常用原料來(lái)制備酶液。例如王寧芳［7］以 pH 為7.2的 Na2HPO4-HCl緩沖溶液為體系，通過(guò)研磨擠壓、過(guò)濾、離心分離，提取馬鈴薯中的酪氨酸酶，用分光光度計(jì)在480 nm處測(cè)定馬鈴薯提取液的吸光度，以吸光度對(duì)時(shí)間的變化率為反應(yīng)速率，建立多巴溶液的轉(zhuǎn)換動(dòng)力學(xué)曲線;發(fā)現(xiàn)所測(cè)數(shù)據(jù)波動(dòng)小，酪氨酸酶的催化活性穩(wěn)定性高，準(zhǔn)確度高且效果好，但是多巴價(jià)格昂貴。魯衛(wèi)斌等［8］則以鄰苯二酚(兒茶酚)為底物研究自制馬鈴薯酪氨酸酶，發(fā)現(xiàn)其催化產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)為410 nm，最佳反應(yīng)條件為 pH 6.8、30℃;并用其處理羊毛織物，發(fā)現(xiàn)酪氨酸殘基被催化氧化為多巴醌結(jié)構(gòu)，且能與含有—NH2的物質(zhì)反應(yīng)，為進(jìn)一步研究羊毛改性奠定了基礎(chǔ)。樊倩等［9］以新鮮馬鈴薯、紅富士蘋果、紅蛇果、秀珍菇和紫茄子為研究對(duì)象，從中分別提取酪氨酸酶并測(cè)定其酶活力，發(fā)現(xiàn)紫茄子的酪氨酸酶活力最為理想，并選擇鄰苯二酚作為紫茄子酪氨酸酶底物;而后研究了有機(jī)合成、無(wú)機(jī)鹽和天然提取物3大類抑制劑對(duì)酪氨酸酶的催化影響，發(fā)現(xiàn)有機(jī)合成化合物效果最佳。Faridi等［10］從產(chǎn)自伊朗北部的花生中提取酪氨酸酶?；ㄉ砸簯B(tài)氮為體系，隨后通過(guò)(NH4)2SO4沉淀和透析。電泳顯示存在2個(gè)可能的同工酶。酶活性在純化的不同階段中進(jìn)行測(cè)定，也測(cè)量一些具有重要物理性質(zhì)的酶。結(jié)果表明，花生酪氨酸酶的最佳pH為5.2、最適溫度為40℃。動(dòng)力學(xué)研究也確定了米氏常數(shù) Km=257.5 mmol，最大反應(yīng)速度Vmax=0.004 21 mmol/min。

目前，已從各種微生物中分離出不同特性的酪氨酸酶，但要用于商業(yè)目的，其成本高、效率低、產(chǎn)量少仍是棘手問(wèn)題。隨著生物技術(shù)的成熟發(fā)展，利用基因工程構(gòu)建大量高效的酪氨酸酶工程菌已成為可能。Dolashki等［11］對(duì)土壤細(xì)菌產(chǎn)酪氨酸酶進(jìn)行分離和鑒定。通過(guò)離心分離，而后經(jīng)過(guò)(NH4)2SO4沉淀法和超濾法獲得粗酶，除去褐色素(可能黑色素)后，通過(guò)體積排阻色譜進(jìn)一步分離天然蛋白質(zhì)混合物獲得純化酶。雙酚基質(zhì)L-多巴、多巴胺以及單酚基質(zhì)L-酪氨酸的動(dòng)力學(xué)參數(shù)已確定，即 Km為4.5、1.5 和0.055 mmol/L，純化酶最大活性條件為pH 6.8。王戈林等［12］在微生物產(chǎn)黑色素的發(fā)酵條件研究中，將嗜麥芽假單胞菌的酪氨酸酶基因用重組DNA技術(shù)轉(zhuǎn)入大腸桿菌HB101中，獲得了酪氨酸酶基因表達(dá)較好的工程菌WY8。何偉等［13］采用比較酪氨酸酶的同源保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的方法設(shè)計(jì)引物，從蘇云金芽孢桿菌4D11中通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了包含酪氨酸酶基因的DNA片段，并在大腸桿菌中獲得了表達(dá)，驗(yàn)證了該基因產(chǎn)生的黑色素可在一定程度上保護(hù)菌體免受紫外輻射，為構(gòu)建產(chǎn)黑色素殺蟲基因工程菌提供了有益的參考。Ren等［14］基于 V.spinosum中的酪氨酸酶基因在大腸桿菌中的成功克隆，建立了1個(gè)酪氨酸酶在大腸桿菌中高效表達(dá)的有效模式，并對(duì)溫度、誘導(dǎo)物濃度以及不同操作模式下誘導(dǎo)的啟動(dòng)時(shí)間進(jìn)行了研究，經(jīng)過(guò)28 h的孵化獲得大約3 g/L活性的酪氨酸酶。

3 酪氨酸酶的應(yīng)用研究

作為1種重要的生物資源，酪氨酸酶有著廣泛的用途，在生物體內(nèi)具有多種重要的生理功能，特別在皮膚美白、抗氧化作用等方面表現(xiàn)尤為突出。另外，結(jié)合固定化［15］、生物傳感器等技術(shù)，在有機(jī)合成、環(huán)境保護(hù)、生物檢測(cè)等領(lǐng)域，利用酪氨酸酶進(jìn)行催化氧化、處理工業(yè)廢水、檢測(cè)化合物等方向已經(jīng)逐漸成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

3.1 有機(jī)合成方面

酪氨酸酶的氧化反應(yīng)可廣泛用于有機(jī)合成領(lǐng)域，可以利用其選擇性羥基化、催化生成活潑中間體合成新化合物等，合成化學(xué)方法難以一步合成的化學(xué)物質(zhì)或難以實(shí)現(xiàn)的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。如Müller等［16］報(bào)道了在氯仿中由固定化酪氨酸酶催化苯酚串聯(lián)羥基化/氧化/Diels-Alder反應(yīng)生成二環(huán)［2.2.2］辛烯二酮的一系列合成;徐迪等［17］發(fā)現(xiàn)用固定化酪氨酸酶催化4-取代烷基或烷氧基單酚類化合物的氧化反應(yīng)可得到相應(yīng)的4-取代鄰苯醌，這類鄰苯醌能和芳香胺發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，烷基或烷氧基從醌環(huán)4位上脫落，繼而得到三取代胺的化合物。將抗炎藥布洛芬引入到單酚的苯環(huán)4位上，在酪氨酸酶和芳香胺同時(shí)存在的條件下，也得到脫布洛芬的加成取代產(chǎn)物，顯示4-羥基布洛芬苯酚酯可作為布洛芬藥物載體;另外，以對(duì)芐氧基苯酚、對(duì)芐基苯酚和對(duì)苯氧基苯酚為底物，初步探討了在無(wú)溶劑體系中酪氨酸酶催化與鄰氨基苯甲醚的氧化-邁克爾加成反應(yīng)，并考察了各因素對(duì)該反應(yīng)速率的影響［18］;Casella 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸酶對(duì)苯硫基甲烷(茴香硫醚)具有硫化氧化作用，可以獲得高對(duì)映體過(guò)剩值的(R)-亞砜。這一發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了酪氨酸酶催化底物的范圍，也為生物法生產(chǎn)高光學(xué)純度的手性化合物開(kāi)辟了一條新途徑;Stratford等［20］發(fā)現(xiàn)4-氟鄰苯二酚在水緩沖液中由酪氨酸酶催化氧化生成的4-氟-1，2-苯醌，可通過(guò)鄰位親核試劑(水或兒茶酚類)快速進(jìn)行替換，并釋放氟離子。4-氯及4-溴鄰苯二酚也有類似反應(yīng);Brooks等［21］實(shí)現(xiàn)了蘑菇酪氨酸酶催化生成1個(gè)手性乙醇——1-(3，4-二羥苯基)乙醇，這是從非手性底物通過(guò)酪氨酸酶產(chǎn)生的第一個(gè)手性產(chǎn)品。

3.2 醫(yī)藥美容方面

3.2.1 國(guó)內(nèi)研究近況

陳景華等［22］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.5 ～2 g/L 當(dāng)歸提取物能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P＜0.01);0.25～2 g/L質(zhì)量濃度可明顯抑制黑素合成(P＜0.05或P＜0.01);不同濃度提取物均能顯著抑制酪氨酸酶，其中1、2 g/L試驗(yàn)組抑制作用比熊果苷組(P＜0.01)弱，0.125、0.25 和0.5 g/L 試驗(yàn)組和熊果苷組相當(dāng)。樸香蘭等［23］將連翹用乙醇回流提取，用二氯甲烷、正丁醇和水萃取其有效成分，并檢測(cè)出它們均呈濃度依賴性的抑制酪氨酸酶活性。通過(guò)硅膠色譜柱法分離成分，利用質(zhì)譜、核磁共振分析手段鑒定出酪氨酸酶抑制成分為白樺脂酸，為五環(huán)三萜類化合物，其 IC50值為(138.5 ± 1.6)μmol/L。唐建陽(yáng)等［24］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10.5 μg/mL 時(shí)，砂仁的30%乙醇提取物(體積分?jǐn)?shù))可使單酚酶的穩(wěn)定態(tài)酶活力下降40%，遲滯時(shí)間延長(zhǎng)了3.12倍;對(duì)二酚酶活力的抑制作用也呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系，酶活力下降60%，IC50值為64 μg/mL，作用機(jī)制為可逆混合型抑制，抑制常數(shù)K1和 K1S分別為41.85和98.51 μg/mL。穆燕等［25］研究發(fā)現(xiàn)，以體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇水溶液為溶劑的白附子粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用最強(qiáng)，抑制率可達(dá)96.35%;與酪氨酸酶抑制率可達(dá)90.7%的恒溫水浴振蕩提取法相比，超聲波輔助提取法的抑制率達(dá)98.1%。在此提取條件下所得的白附子粗提物的 IC50值為 24.69 μg/mL。孫培冬等［26］測(cè)定出藤茶中二氫楊梅素對(duì)酪氨酸酶單酚酶的抑制率為95.87%，抑制作用表現(xiàn)為酶催化反應(yīng)的遲滯時(shí)間延長(zhǎng);二氫楊梅素對(duì)二酚酶的抑制率為69.01%，抑制作用表現(xiàn)為可逆混合型抑制，對(duì)游離酶的抑制常數(shù)和對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)分別為150和83 μmol/L。沈曉佳等［27］研究發(fā)現(xiàn)，紫娟茶的3種提取物對(duì)酪氨酸酶單酚酶和二酚酶均有較好的抑制作用，尤其是含有花青素和茶多酚混合物的提取物I。嚴(yán)航等［28］通過(guò)添加8倍量的體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇提取2 h，以進(jìn)行優(yōu)化工藝，測(cè)定得出提取2次得到的薏苡仁提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率達(dá) 33.3%，IC50值為 1.4 mg/mL;Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖顯示，薏苡仁提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用屬于線性混合型抑制。李紅艷等［29］的篩選結(jié)果顯示，紅花水提物的酪氨酸酶抑制作用較強(qiáng)，推測(cè)其中9種成分可能具有酪氨酸酶抑制作用，選取驗(yàn)證并確認(rèn)了羥基紅花黃色素A對(duì)酪氨酸酶的抑制作用較為明顯。

3.2.2 國(guó)外研究近況

Dung等［30］評(píng)估了金銀花的花、葉、枝各部分的乙醇提取物的酚類物質(zhì)、抗氧化性以及酪氨酸酶的抑制活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，花、葉、枝的酚類物質(zhì)提取率分別為30.00、18.57 和9.12 mg/g;抑制酪氨酸酶活性的 IC50值分別為(11.16 ±2.61)、(15.81 ±3.89)和(17.18 ± 1.76)μg/mL，對(duì)照品曲酸為(3.50 ±0.94)μg/mL。Zhang 等［31］從靈芝的乙醇可溶性酸性成分(ESACs)分離出赤芝酸 F甲酯(methyl lucidenate F)，以鄰苯二酚為底物測(cè)定酪氨酸酶的抑制活性，結(jié)果顯示為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，Lineweaver-Burk 圖中 Vmax為 0.436 7 min-1，Km為6.765 mmol/L，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制常數(shù)(KI)為 19.22 μmol/L，同時(shí)赤芝酸F甲酯顯示出高度酪氨酸酶抑制活性，其 IC50值為 32.23 μmol/L。Kim 等［32］從黃芪中分離出毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡糖苷，檢測(cè)出其酪氨酸酶抑制活性的IC50值為68 μmol/L，其降低Melan-A 細(xì)胞黑色素含量的 IC50值為 75.78 μmol/L。Ding等［33］對(duì)牡丹根皮提取物(Ps-1到 Ps-8)的抗氧化性能和抗黑色素生成進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中Ps-8的清除自由基能力、鏊合離子能力、還原能力以及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)較強(qiáng)，可能是因?yàn)楹胸S富的黃酮類和酚類;提取物Ps-1，尤其是提取物Ps-6大大抑制了B16細(xì)胞酪氨酸酶和多巴氧化酶的活性，并且通過(guò)減少黑素皮質(zhì)受體-1(MC1R)、眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1(TRP-1)的表達(dá)來(lái)減少B16細(xì)胞中黑色素的含量。Li等［34］在銀合歡中發(fā)現(xiàn)抗氧化劑羽扇豆醇和酪氨酸酶抑制劑脫鎂葉綠酸a甲酯，二者均顯示出清除DPPH·的有效活性(維生素C為對(duì)照)以及蘑菇酪氨酸酶的抑制作用(曲酸為對(duì)照)。Zheng等［35］在小葉桑的根中發(fā)現(xiàn)包括austraone A在內(nèi)的22種新化合物，并通過(guò)質(zhì)譜和核磁共振譜確定其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在酪氨酸酶活性抑制的測(cè)試中，其中氧化白藜蘆醇、桑白皮素D、桑根酮T以及桑酮O的酪氨酸酶抑制作用比曲酸強(qiáng)。Chen等［36］的結(jié)果表明，紅花黃色素以劑量依賴性方式抑制蘑菇酪氨酸酶活性，其 IC50值約為(1.01 ±0.03)mg/mL;動(dòng)力學(xué)研究顯示為競(jìng)爭(zhēng)性抑制模式，KI為0.607 mg/mL;細(xì)胞活力分析表明，1.0～4.0 mg/mL的紅花黃色素質(zhì)量濃度對(duì)B16F10黑色素瘤細(xì)胞并無(wú)細(xì)胞毒性作用，使用4.0 mg/mL的紅花黃色素可使B16F10黑色素瘤細(xì)胞的黑素產(chǎn)生降至(82.3±0.4)%。

3.3 環(huán)境保護(hù)方面

酪氨酸酶能夠催化氧化單酚化合物，Wada等［37］研究表明，其清除水溶液中取代苯酚的速率依次為鄰苯二酚、對(duì)甲苯酚、對(duì)氯苯酚、苯酚和對(duì)甲氧基苯酚。酪氨酸酶不僅能除去酚類物質(zhì)，還能去除有機(jī)胺等多種有機(jī)物，最終形成沉淀而易被處理。因此，可以利用微生物中的酪氨酸酶，用于工廠、醫(yī)院等環(huán)境工程領(lǐng)域中來(lái)以降解處理酚類及胺類廢水［38］。

隨著處理工藝的不斷摸索，其反應(yīng)條件逐漸得到優(yōu)化。Ikehata等［39］觀察到蘑菇酪氨酸酶去除廢水中酚類化合物最大催化活性的pH為7，超過(guò)最佳活性50%的pH范圍為5～8。酪氨酸酶在高溫和酸性條件下不穩(wěn)定，以L-酪氨酸為底物，在pH為7的條件下熱鈍化酪氨酸酶的活化能為1.85 kJ/mol。Yamada等［40］發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶與殼聚糖組合去除人工廢水中酚類化合物的效果較好。酪氨酸酶催化氧化苯酚化合物成為醌的衍生物，隨后化學(xué)吸附到殼聚糖膜上。對(duì)甲基苯酚而言，決定醌吸附的最佳條件是pH為7，溫度為45℃。某些烷基取代酚，比如對(duì)甲基苯酚、對(duì)乙基苯酚、對(duì)丙基苯酚、對(duì)丁基苯酚和對(duì)氯苯酚的去除率可達(dá)93%。另外，Palma等［41］開(kāi)發(fā)了1種在攪拌容器中使用純酪氨酸酶的新型經(jīng)濟(jì)酶法工藝處理酚類污染物，確定了最佳反應(yīng)條件(溫度45 ℃、pH 6.6、轉(zhuǎn)速400 r/min、初始苯酚質(zhì)量濃度0.000 1 mol/L和酶質(zhì)量濃度50 U/mL)下酪氨酸酶的氧化效率為88.1%，初始氧化速率為10.2 mg/(L·min)，以及達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)所需時(shí)間為40 min。

固定化技術(shù)的普及，使得固定化材料具有廣大的發(fā)展空間。將酪氨酸酶固定化到疏水基團(tuán)修飾的瓊脂珠上，蛋白吸附率和酶活力回收分別達(dá)到了90%和80%［42］;而通過(guò)酶中的氨基基團(tuán)固定于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的酪氨酸酶可重復(fù)使用，2 h后苯酚完全移除并且重復(fù)使用10次之后其活性幾乎沒(méi)有減弱［37］;固定于改性的鋁硅酸鈉(NaA)和鋁硅酸鈣(CaA)的酪氨酸酶也可使用多次且活性沒(méi)有絲毫下降［43］。邵健等［44］將酪氨酸酶固定于海藻酸鈉/二氧化硅(ALG/SiO2)凝膠復(fù)合物中，發(fā)現(xiàn)pH為7.0時(shí)，固定化酪氨酸酶的比酶活為1 120 U/g，25℃時(shí)以鄰苯二酚為底物的Km為10.6 mmol/L。相對(duì)于游離酶和海藻酸鈉固定化酶，該雜化凝膠固定酪氨酸酶具有良好的熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性及連續(xù)使用性。Bayramoglu等［45］使用天然生物礦化硅藻開(kāi)發(fā)了1個(gè)新型酪氨酸酶固定化系統(tǒng)，使得有望替代傳統(tǒng)合成的高分子材料。Xu等［46］采用實(shí)用又經(jīng)濟(jì)的交聯(lián)法，又稱無(wú)載體固定化法，獲得交聯(lián)酪氨酸酶聚集體作為催化劑，有效治理污水中的酚類化合物。同時(shí)，納米材料與多酚氧化酶形成的復(fù)合物可有效減少傳統(tǒng)酶處理污水的缺點(diǎn)［47］。

3.4 生物檢測(cè)方面

生物傳感器作為生物檢測(cè)的1種新興技術(shù)，是將酶、DNA、抗體、細(xì)胞等作為分子識(shí)別物質(zhì)固定在傳導(dǎo)器上，將化學(xué)變化、熱變化等轉(zhuǎn)變成電信號(hào)的分析器件，具有靈敏、專一、微量、快速和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于空間生命科學(xué)、食品工業(yè)、環(huán)境工程、發(fā)酵工程以及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域［48］。柳亞玲［49］探討了非導(dǎo)電聚合物固定的酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)滅菌磷、甲基氯吡硫磷、二嗪磷和碘硫磷4種有機(jī)磷農(nóng)藥的效果;Wu等［50］利用納米級(jí)石墨烯為基本成分的酪氨酸酶生物傳感器快速檢測(cè)到雙酚A;Yang等［51］研制了1種基于殼聚糖-碳包覆鎳復(fù)合膜的新型酪氨酸酶生物傳感器，用于檢測(cè)兒茶酚，具有快速、可重復(fù)使用以及穩(wěn)定性好的特點(diǎn);Jiang等［52］基于層層組裝技術(shù)，創(chuàng)建了固定化毛細(xì)管酪氨酸酶反應(yīng)器，用于篩選酪氨酸酶抑制劑，并經(jīng)19種天然中藥提取物進(jìn)行篩選驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)固定酶能夠承受連續(xù)25次檢測(cè)，而僅失去12%的活性;Sigolaeva等［53］也通過(guò)層層組裝技術(shù)，利用聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDDA)/酪氨酸酶/戊二醛石墨基質(zhì)生物傳感器測(cè)定血液中羧酸酯酶和神經(jīng)病變靶酯酶的活性，表現(xiàn)出了良好的再現(xiàn)性;Singh等［54］提出了1種利用表面等離子體激元共振(SPR)建立的光纖生物傳感器，用于檢測(cè)水溶液中的酚醛化合物。通過(guò)熱蒸發(fā)技術(shù)將銀膜沉積在光纖芯上以制備傳感探頭，而后使用凝膠誘捕技術(shù)固定酪氨酸酶。

4 展望

酪氨酸酶具有操作條件溫和、反應(yīng)專一、可重復(fù)使用等特點(diǎn)，被廣泛用于食品、美容、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域。由于酪氨酸酶在生物體內(nèi)含量低，目前由植物來(lái)制備酪氨酸的研究未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)室用作制備酪氨酸酶的原料較為單一(蘑菇、馬鈴薯、蘋果)。針對(duì)進(jìn)口純酶價(jià)格昂貴且需求量大的問(wèn)題，今后的主要研究任務(wù)是提高國(guó)內(nèi)生產(chǎn)酪氨酸酶的能力，擴(kuò)展該酶來(lái)源物種種類。同時(shí)，應(yīng)用基因重組等生物學(xué)技術(shù)制備優(yōu)質(zhì)高效表達(dá)酪氨酸酶基因的工程菌是其制備技術(shù)的發(fā)展方向，有望提高酪氨酸酶的產(chǎn)量。

作為國(guó)內(nèi)外皮膚美白產(chǎn)品的重點(diǎn)研究對(duì)象，以天然產(chǎn)物為來(lái)源的酪氨酸酶抑制劑，具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)其增效減毒、美白機(jī)制等的研究也將是重點(diǎn)方向。另外，隨著對(duì)酪氨酸酶性質(zhì)和功能的深入了解，以固定化技術(shù)為代表的酶工程技術(shù)的應(yīng)用，已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)新型材料的研究熱點(diǎn)之一。隨著化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多學(xué)科及相關(guān)多技術(shù)的不斷發(fā)展、交叉和融合，將有利于拓展酪氨酸酶的研究和應(yīng)用。

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