袁明杰，孔彬，胡紅耀，權(quán)力，王鑫，梁錦軍，唐艷紅

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢 430060)

·論著·

Ghrelin及其受體在大鼠心肌梗死后的動態(tài)表達(dá)

袁明杰，孔彬，胡紅耀，權(quán)力，王鑫，梁錦軍，唐艷紅

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢 430060)

目的Ghrelin是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的生長激素釋放肽，具有心血管保護(hù)效應(yīng)。本研究旨在觀察心肌梗死(MI)后Ghrelin及其受體GHSR-1a的動態(tài)表達(dá)及其變化。方法30只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為四組，分別為假手術(shù)組(6只)，心肌梗死后3 d組(8只)，梗死7 d組(8只)，梗死28 d組(8只)。采用冠狀動脈結(jié)扎法制作心肌梗死模型，假手術(shù)組只在冠狀動脈下穿線，但不結(jié)扎。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測梗死邊緣心肌Ghrelin及GHSR-1a mRNA表達(dá)，免疫印跡法檢測梗死邊緣心肌Ghrelin及GHSR-1a蛋白表達(dá)及分布。結(jié)果與假手術(shù)組比較，MI后3 d、7 d、28 d梗死周邊區(qū)域心肌中Ghrelin mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，且呈逐漸下降趨勢；而GHSR-1a mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05)；梗死3 d組與梗死7 d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。免疫印跡顯示假手術(shù)組大鼠心肌顯示出了較強(qiáng)的Ghrelin陽性表達(dá)，而心肌梗死后Ghrelin陽性表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；與此相反，GHSR-1a蛋白表達(dá)在梗死后明顯增加(P＜0.05)。結(jié)論Ghrelin/GHSR-1a系統(tǒng)在梗死后心臟重構(gòu)中可能起著重要作用，并可作為防止心臟重構(gòu)的一個新的干預(yù)靶點(diǎn)。

Ghrelin；GHSR-1a；心肌梗死；心臟重構(gòu)

心肌梗死(Myocardial infarction，MI)是臨床常見的心血管系統(tǒng)疾病之一，死亡率高。隨著診療技術(shù)的提高，目前生存率得到了顯著的提高，但是心肌壞死后將進(jìn)一步引起心室重構(gòu)、心律失常和心力衰竭。MI后心臟的一系列變化時(shí)動態(tài)進(jìn)展與壓力負(fù)荷增加、交感神經(jīng)活性增強(qiáng)及RAS系統(tǒng)的活化密切相關(guān)，多種炎癥介質(zhì)也參與其中。心功能的進(jìn)行性下降，最終導(dǎo)致心力衰竭。

Ghrelin是一種促生長激素釋放激素，作為內(nèi)源性的配體，能與體內(nèi)生長激素促分泌素受體(GHSR)相結(jié)合，發(fā)揮生理功能[1]。以往的研究顯示，Ghrelin具有多種心血管保護(hù)功能，包括：抗炎作用[2-3]，舒血管效應(yīng)[4]，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝，改善心臟惡病質(zhì)等[5-6]。

充分的了解MI后Ghrelin及其受體的動態(tài)變化有利于明確Ghrelin心臟保護(hù)作用的作用靶點(diǎn)，幫助闡明其作用機(jī)制，為其藥用價(jià)值的開發(fā)提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過建立大鼠MI模型，觀察不同時(shí)間段心肌組織中Ghrelin及其受體的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物30只成年雄性SD大鼠，10周齡，體重為(250±30)g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)動物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字的方法被隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組6只，心肌梗死組24只(心梗后3 d組、7 d組及28 d組，每組各8只)。實(shí)驗(yàn)動物在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物房SPF環(huán)境中喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境符合實(shí)驗(yàn)條件要求。

1.2 主要試劑3%戊巴比妥鈉，北京化工廠；DEPC處理水，碧云天生物技術(shù)研究所；Trizol購自美國Invitrogen公司；Marker及引物由上海生工合成；PCR試劑盒購自武漢眾一生物科技公司；Ghrelin及GHSR-1a多克隆抗體，Abcam公司；HRP標(biāo)記羊抗兔多克隆抗體，碧云天生物技術(shù)研究所；S-P免疫組化試劑盒購自深圳晶美生物科技公司。

1.3 主要儀器小動物實(shí)驗(yàn)器械，上海手術(shù)器械廠；小動物呼吸機(jī)(TKR-200C型)，江西特力麻醉呼吸設(shè)備公司；LEAD-2000B32道電生理記錄儀，中國四川錦江通用實(shí)業(yè)有限公司；壓力換能器，上海益聯(lián)科教設(shè)備有限公司；MDF392超低溫冰箱，日本三洋公司；低溫高速離心機(jī)，德國Heraeus公司；熒光定量PCR擴(kuò)增儀，Biometra；VL凝膠成像分析系統(tǒng)

1.4 模型制作大鼠稱重后，用3%戊巴比妥鈉以30 mg/kg的劑量經(jīng)腹腔注射麻醉，待呼吸平穩(wěn)后，將大鼠后背位固定于實(shí)驗(yàn)用木板上，將心電圖針形電極插入四肢皮下，用肢體導(dǎo)聯(lián)進(jìn)行心電圖監(jiān)測。頸部皮膚備皮，常規(guī)消毒。于左心耳根部下方2 mm處結(jié)扎冠狀動脈前降支。在肺動脈圓錐和左心耳之間進(jìn)針，進(jìn)針深度0.5 mm，以6/0縫線穿過心肌表層，在肺動脈圓椎側(cè)出針，并觀察心電圖變化。如發(fā)現(xiàn)結(jié)扎線以下區(qū)域立刻變成暗紅色，同時(shí)I、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高大于0.2 mV并持續(xù)0.5 h以上，則說明結(jié)扎成功。術(shù)后擠壓胸腔，排出殘留空氣，清除胸腔內(nèi)積血，逐層縫合關(guān)閉胸腔。待動物蘇醒后拔除氣管插管，縫合頸部切口。術(shù)后每天肌肉注射青霉素40萬U，共3 d，預(yù)防感染。假手術(shù)組，只在開胸暴露心臟后，在冠脈前降支下穿線，而不結(jié)扎。

1.5 標(biāo)本留取分別在術(shù)后3 d、7 d及28 d迅速處死動物，迅速處死動物，取出心臟，用生理鹽水洗凈。沿房室環(huán)剪去左右心房及右室游離壁。沿著心臟長軸，從結(jié)扎點(diǎn)將左心室剪成兩半。一半立刻保存在-80℃冰箱，作為后面的Real-time PCR研究。另一半在4%中性福爾馬林中固定后作為免疫組化研究。梗死邊緣區(qū)界定為梗死疤痕外0.5～1.0 mm。為了避免混淆梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)左室心肌，在留取標(biāo)本時(shí)，梗死邊緣區(qū)外1～2 mm心肌被去除掉。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR取心肌組織100～150 mg，加入1 ml TRIZOL，冰上勻漿，提取總RNA，采用PCR試劑盒擴(kuò)增目的基因。引物序列設(shè)計(jì)如下：Ghrelin，上游5'-GAAGCCACCAGCTAAACTGC-3'，下游5'-TGCTGGTACTGAGCTCCTGA-3'；GHSR-1a，上游5'-CTCGGATCTGCTCATCTTCC-3'，下游5'-GGAAGC AGATGGCGAAGTAG-3'；用GAPDH(100 bp)作為參照，其引物序列為：上游5'-GCAAGTTCAACGGCACAG3-'，下游5'-ATTTGATGTTAGCGGGAT-3'。PCR反應(yīng)儀設(shè)置條件為94℃5 min，其后以94℃變性10 s；58℃退火10 s，72℃延伸5 s，循環(huán)45個周期，最后72℃4 min終止。反應(yīng)完成后計(jì)算機(jī)自動分析ct值。根據(jù)溶解曲線和產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷反應(yīng)產(chǎn)物特異性。目的基因相對GAPDH的含量表達(dá)采用2-⊿⊿CT方法計(jì)算[7]。

1.7 免疫組化研究切片經(jīng)常規(guī)二甲苯、梯度乙醇脫蠟后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min×3次。浸入新鮮配置的3%H2O2溶液10～15 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，并行酶消化抗原修復(fù)。滴加正常山羊血清，室溫孵育10～15 min以封閉荷電點(diǎn)，直接在切片上滴加Ghrelin及GHSR-1a多克隆抗體(工作濃度1:100)，37℃孵育1 h后轉(zhuǎn)入4℃冰箱，放置24 h。PBS洗滌后滴加生物素化山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育20 min，滴加試劑SABC，37℃孵育40 min。最后鏡下DAB顯色，PBS終止反應(yīng)。經(jīng)蘇木素復(fù)染后脫水，樹膠封片。顯微鏡下觀察陽性表達(dá)密度在總面積中所占的比例。

2 結(jié)果

2.1 心肌Ghrelin mRNA與GHSR-1a mRNA表達(dá)的動態(tài)改變Ghrelin和GHSR-1a擴(kuò)增曲線及溶解曲線見圖1(A-D)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，MI后3 d、7 d至28 d梗死周邊區(qū)域心肌中Ghrelin mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，且呈逐漸下降趨勢；但梗死3 d組與梗死7 d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與假手術(shù)組比較，MI后3 d、7 d至28 d梗死周邊區(qū)域心肌中GHSR-1a mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，且隨著梗死時(shí)間的延長，其表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(P＜0.05)，見圖1～4。

圖1 Ghrelin擴(kuò)增曲線(A)及溶解曲線(B)，GHSR-1a擴(kuò)增曲線(C)及溶解曲線(D)。目的基因溶解曲線都只有一個高峰，提示引物設(shè)計(jì)特異，擴(kuò)增高效。

圖2 A Ghrelin mRNA電泳圖；B GHSR-1a mRNA電泳圖

2.2 心肌Ghrelin及其受體GHSR-1a的表達(dá)及分布如圖3所示，假手術(shù)組大鼠心肌顯示出了較強(qiáng)的Ghrelin陽性表達(dá)，而心肌梗死后3 d、7 d及28 d，Ghrelin陽性表達(dá)明顯較假手術(shù)組降低(P＜0.05)；GHSR-1a在正常心肌中表達(dá)量很少，而心肌梗死后GHSR-1a表達(dá)明顯增加，且隨著時(shí)間延長，其表達(dá)量呈逐漸升高趨勢，見圖4(P＜0.05)。

圖3 Ghrelin免疫表達(dá)

圖4 GHSR-1a免疫表達(dá)

3 討論

Ghrelin最早是日本學(xué)者在動物的胃內(nèi)分離得到的，主要在胃腸組織表達(dá)，在全身其他組織也有分布[8]。Ghrelin的生物學(xué)效應(yīng)部分是通過其受體GHSR介導(dǎo)。(GHSR)為G蛋白耦聯(lián)受體，廣泛分布于下丘腦、垂體、心臟、胰腺、腸、脂肪組織、性腺等多種組織器官，主要包括GHSR-1a和GHSR-1b兩種亞型，Ghrelin經(jīng)過乙酰化后主要與GHSR-1a結(jié)合發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)Ghrelin在心臟細(xì)胞本身及血管內(nèi)皮細(xì)胞中可自身合成，而GHSR在心血管組織中也有表達(dá)，這提示Ghrelin可能直接對心血管系統(tǒng)發(fā)揮作用[3，9]。

目前Ghrelin對心血管的作用效應(yīng)還存在爭論。心肌細(xì)胞可以生成和分泌Ghrelin。近期研究表明Ghrelin可以促進(jìn)人類胚胎干細(xì)胞在梗死心肌環(huán)境中生存和分化[10]。通過激活GHSR-1a，Ghrelin對缺血心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，防止缺血再灌注損傷及防止惡性心律失常的發(fā)生[11-12]。Ghrelin也可以改善缺血心肌的能量代謝并且防止血管緊張素誘導(dǎo)的心肌損傷。然而也有學(xué)者提出了不一樣的意見，Ghrelin直接注射并不能對GH缺乏的患者產(chǎn)生心血管效應(yīng)，且動物研究也發(fā)現(xiàn)Ghrelin并不能改善心功能及減小心臟擴(kuò)大[13-14]。

本研究成功制作了大鼠心肌梗死模型。通過研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死后，隨著時(shí)間的延長，梗死區(qū)域及梗死周邊區(qū)域的Ghrelin表達(dá)量是動態(tài)降低的，于28 d明顯降低。而梗死區(qū)及梗死周邊區(qū)GHSR-1a的表達(dá)量則是動態(tài)升高的，于28 d明顯升高。上述這些動態(tài)變化將減弱Ghrelin的心血管保護(hù)作用，而損傷因子持續(xù)存在，最終導(dǎo)致心衰的發(fā)生。也有研究認(rèn)為在嚴(yán)重心衰患者中，血漿Ghrelin水平是降低的，且與增加的生長因子及炎癥因子呈正相關(guān)[15]，筆者推測血漿Ghrelin水平增高可能是對心肌組織Ghrelin表達(dá)的代償反應(yīng)。

生長激素釋放激素GHRH可以直接激活GHSR-1a高脂營養(yǎng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞重構(gòu)伴隨著增加的GHSR-1a表達(dá)，PI3K及Akt[16]。我們推測增加的GHSR-1a表達(dá)可能會對心臟重構(gòu)起保護(hù)作用，但是Ghrelin系統(tǒng)在心血管中的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。進(jìn)一步可研究Ghrelin過表達(dá)對心臟重構(gòu)及心力衰竭的影響。

本研究尚存在一些不足之處，如沒有確切計(jì)算梗死面積，進(jìn)一步Ghrelin及GHSR-1a的空間分布及相關(guān)關(guān)系尚需要進(jìn)一步明確?？傮w來說，Ghrelin/GHSR-1a系統(tǒng)可能在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮積極的作用，但具體機(jī)制尚不明確。

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Expression of Ghrelin and its receptor in rats after coronary artery ligation.

YUAN Ming-jie,KONG Bin,HU Hong-yao,QUAN Li,WANG Xin,LIANG Jin-jun,TANG Yan-hong.Department of Cardiology,Wuhan University Renmin Hospital,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveGhrelin is a novel growth hormone-releasing peptide,which has been shown to exert beneficial effects on cardiac function and ventricular remodeling.The present study aimed to investigate the expression of ghrelin and the growth hormone(GH)secretagogue receptor 1a(GHSR-1a).MethodsAfter ligation of the anterior descending artery(LAD),adult male Sprague-Dawley rats were randomized to 3 d,7 d and 28 d groups,with eight rats in each group.Another six rats underwent thoracotomy and pericardiotomy,but not LAD ligation(Sham group).Expressions of both ghrelin and GHSR-1a were assessed by means of immunohistochemistry and real-time PCR.ResultsCardiac expression of ghrelin increased on day 3,7 and 28 compared with the sham group(P＜0.05).In contrast,the GHSR-1a mRNAlevels increased during the same days(P＜0.05).Decreased expression of ghrelin and increased expression of GHSR-1a were also observed in infarcted heart.ConclusionThe ghrelin/GHSR-1a system may play an important role in regulating cardiac remodeling after MI and provide a potential pharmacological target for treating cardiac remodeling.

Ghrelin;GHSR-1a;Myocardial infarction;Cardiac remodeling

R-332

A

1003—6350（2014）16—2341—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0916

2014-03-10)