劉建榮，顧雅君，張瑞英

（1.河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心；2.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

黑木耳 （Auricularia auricula）是一種食藥兼用的大型真菌，具有潤(rùn)肺補(bǔ)腦、補(bǔ)血養(yǎng)容、止痛止血等多種功效。自20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)真菌多糖具有抗腫瘤活性以來［1］，人們廣泛開展了對(duì)黑木耳多糖的研究，并已證實(shí)其具有抗氧化、降血脂、抗輻射、抗凝血及抑制腫瘤等生物活性［2，3］。硒（Se）是人與動(dòng)物體正常生理活動(dòng)所必需的一種微量元素，人體的貧血、冠心病、大骨節(jié)病、糖尿病、癌癥等多種疾病都與人體內(nèi)缺乏硒元素相關(guān)［4］。然而硒在自然界中的含量相當(dāng)稀少和分散，且常以無(wú)機(jī)鹽態(tài)存在，不利于人體吸收。黑木耳菌絲體具有很強(qiáng)的富硒能力［5］，能將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)的硒多糖和硒蛋白，而黑木耳硒多糖對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用優(yōu)于黑木耳多糖［6］。因此，富硒食用菌制品的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)。本研究對(duì)黑木耳冀誘1號(hào)的最適液體發(fā)酵培養(yǎng)基增補(bǔ)亞硒酸鈉進(jìn)行富硒發(fā)酵，以期獲得富硒1菌絲體，改善黑木耳品質(zhì)，從而為開發(fā)富硒黑木耳食藥制品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種和儀器

黑木耳冀誘1號(hào)品種（由河北省科學(xué)院微生物研究所提供）；UV－1800紫外可見分光光度計(jì)（天美有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 PDA斜面培養(yǎng)基（g／L）

去皮馬鈴薯200g，切碎，加水1000ml，煮沸30min，紗布過濾后加瓊脂20g，加熱溶解后加葡萄糖20g，分裝試管，121℃濕熱滅菌20min后取出，擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）

培養(yǎng)基A：蔗糖30g，麩皮煮汁50g，酵母膏5g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，自然pH。

培養(yǎng)基B：去皮馬鈴薯200g，硫酸鎂1g，VB 110mg，葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，自然pH。培養(yǎng)基C：葡萄糖20g，豆餅粉5g，硫酸鎂0.5g，磷酸二氫鉀2g，自然pH。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

用接種鏟將斜面保存菌種分割為黃豆粒大小的小菌塊，轉(zhuǎn)移到新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基上，26℃下恒溫培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面試管后使用。

1.3.2 最適液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間的確定

選擇3種不同碳氮源的培養(yǎng)基A、B和C，分別配制1000ml，分裝于5個(gè)500ml三角瓶中，使培養(yǎng)基裝液量為200ml。將已活化的PDA斜面菌種切割成黃豆粒大小的小菌塊，接種3塊于200ml液體培養(yǎng)基中，每組做5個(gè)平行試驗(yàn)。于26℃200r／min振蕩培養(yǎng)，分別在3，4，5，6，7和8d測(cè)定每組發(fā)酵液的平均多糖含量和生物量，以確定菌絲體生長(zhǎng)最適液體培養(yǎng)基。

1.3.3 黑木耳的富硒液體發(fā)酵

選擇菌絲生長(zhǎng)最適的液體培養(yǎng)基配制1000ml，于5個(gè)500ml三角瓶中各分裝200ml。準(zhǔn)確稱取2，6，10，14和18mg亞硒酸鈉依次置于5個(gè)三角瓶中，使亞硒酸鈉濃度依次為10，30，50，70和90mg／L液體培養(yǎng)基。滅菌后接種3塊切割為黃豆粒大小的PDA活化菌種，200r／min于上述1.3.2確定的最佳條件進(jìn)行富硒液體發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，分別取樣測(cè)定不同硒濃度下的發(fā)酵液多糖含量和菌絲體生物量、含硒量。

1.3.4 多糖的測(cè)定

發(fā)酵液多糖測(cè)定方法依照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。

1.3.5 生物量的測(cè)定

于搖床發(fā)酵的不同時(shí)間無(wú)菌取出20ml發(fā)酵液，用150目銅篩網(wǎng)過濾，菌球以蒸餾水多次洗滌后，置于培養(yǎng)皿中于105℃烘干至恒重，分析天平稱重各組菌球。

1.3.6 硒含量的測(cè)定

黑木耳富硒發(fā)酵液中菌絲體硒含量測(cè)定依照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。

2 結(jié)果和討論

2.1 最適液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間的確定

通過對(duì)黑木耳發(fā)酵液多糖含量和菌絲體生物量的測(cè)定，以確定黑木耳液體發(fā)酵最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)黑木耳發(fā)酵液多糖含量的影響

圖2 不同培養(yǎng)基對(duì)黑木耳發(fā)酵液菌絲體生物量的影響

由圖1和圖2可知，在3組液體培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液多糖含量和菌絲體生物量均呈上升趨勢(shì)，6d達(dá)到最高值，之后逐漸下降；多糖含量和菌絲體生物量均以培養(yǎng)基C為最高，在6d時(shí)多糖含量和菌絲體生物量分別為20.3g／L和9.37g／L。因此，以液體培養(yǎng)基C培養(yǎng)6d為黑木耳液體發(fā)酵的最適條件。結(jié)果表明，氮碳源為豆餅粉和葡萄糖的條件下較其他碳氮源黑木耳更容易生長(zhǎng)。培養(yǎng)6d后多糖含量和生物量達(dá)到最大值，超過6d，黑木耳的生長(zhǎng)即進(jìn)入衰退期。

2.2 黑木耳的富硒液體發(fā)酵

2.2.1 不同硒濃度對(duì)發(fā)酵液菌絲體生物量和硒含量的影響

于優(yōu)選培養(yǎng)基中添加不同硒濃度進(jìn)行黑木耳的富硒液體發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵液中菌絲體生物量和硒含量的測(cè)定結(jié)果如表1所示。硒濃度低于50mg／L時(shí)，菌絲體的生物量和含硒量均隨硒濃度的增高而增加；當(dāng)硒濃度為50mg／L時(shí)，菌絲體的生物量和硒含量均最高，分別為9.37g／L和10.48μg／g，生物量是不加硒時(shí)生物量的1.2倍；高于50mg／L時(shí)，生物量和硒含量均不增高反而降低。結(jié)果表明，黑木耳菌絲體具有富硒能力，但硒濃度過高不利于黑木耳菌絲體的生長(zhǎng)和對(duì)硒的吸收利用。

表1 不同硒濃度對(duì)發(fā)酵液菌絲體生物量和硒含量的影響

2.2.2 不同硒濃度對(duì)發(fā)酵液多糖含量的影響

優(yōu)選培養(yǎng)基中添加不同硒濃度發(fā)酵后對(duì)黑木耳發(fā)酵液的多糖含量測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，亞硒酸鈉在10－50mg／L范圍時(shí)，發(fā)酵液多糖含量隨硒濃度的升高而增加，且高于不添加硒時(shí)的多糖含量，在50mg／L時(shí)達(dá)到最大值，為20.3g／L，是不加硒時(shí)多糖含量的1.3倍，而后多糖含量隨硒濃度的增加而降低，且低于未添加硒時(shí)液體培養(yǎng)基C在6d時(shí)所測(cè)得的多糖含量。結(jié)果表明，液體培養(yǎng)基中添加適量亞硒酸鈉有助于提高發(fā)酵液的多糖含量。

表2 不同硒濃度對(duì)發(fā)酵液多糖含量的影響

3 結(jié)論

黑木耳在不同液體培養(yǎng)基發(fā)酵過程中，通過對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液多糖含量和菌絲體生物量的測(cè)定確定了黑木耳最佳液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g／L，豆餅粉5g／L，硫酸鎂0.5g／L，磷酸二氫鉀2g／L，并于26℃培養(yǎng)6d。

以優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)黑木耳進(jìn)行富硒發(fā)酵，黑木耳的確具有較強(qiáng)富硒能力。但培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的濃度會(huì)影響黑木耳的富硒效果及其生長(zhǎng)和多糖含量。與不添加亞硒酸鈉相比，添加適量亞硒酸鈉有利于黑木耳菌絲體對(duì)硒的最大吸收和利用，并且可促進(jìn)黑木耳的生長(zhǎng)和多糖含量的提高。然而過量添加，不僅會(huì)降低菌絲體對(duì)硒的吸收利用，造成浪費(fèi)，而且抑制黑木耳的生長(zhǎng)和降低多糖含量。

黑木耳的富硒發(fā)酵研究，豐富了有機(jī)硒的來源，為開發(fā)天然有機(jī)硒多糖提供依據(jù)。

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