張 麗，李小穎，孫彩顯，張 旭，陳 煒，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021）

抑制小鼠乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移microRNA的篩選

張 麗，李小穎，孫彩顯，張 旭，陳 煒，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021）

目的 鑒定25種microRNA的功能及其在乳腺癌中發(fā)揮的作用，以篩選新的抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的microRNA分子。方法 利用脂質(zhì)體2000將25種鼠源microRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至4TO7細(xì)胞，經(jīng)G418篩選結(jié)合流式細(xì)胞儀分選獲綠色熒光細(xì)胞得穩(wěn)定表達(dá)鼠源microRNA的細(xì)胞株。將細(xì)胞2×105個/只尾靜脈注射接種于BALB/C小鼠，14 d后解剖分離肺組織，統(tǒng)計小鼠肺組織結(jié)節(jié)數(shù)目。結(jié)果 和接種陰性對照細(xì)胞小鼠相比，接種mir-449a穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移減少。而接種 mir-1935穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移增多。其它23種microRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞接種小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移既不增加也不減少。結(jié)論 從25種鼠源microRNA中篩選到2種與乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的microRNA：mir-449a抑制乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移，mir-1935則促進(jìn)癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移。

4TO7；乳腺癌；小RNA；轉(zhuǎn)移；尾靜脈注射

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計數(shù)據(jù)，美國每年有23萬乳腺癌新發(fā)病例，2012年死亡人數(shù)為4萬。我國屬女性乳腺癌的低發(fā)國，但近年來乳腺癌的發(fā)病率明顯增高，躍居女性惡性腫瘤中的第一位，明顯高于其它癌癥的發(fā)病率。并以每年2％～3％的增長速率遞增，嚴(yán)重危害女性的生命和健康。

乳腺癌患者50％經(jīng)手術(shù)治療后可治愈，50％患者在治療后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，其中30％左右發(fā)生轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡，乳腺癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主因。乳腺癌轉(zhuǎn)移好發(fā)的部位依次是肺、骨和腦等。轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤往往對于傳統(tǒng)的腫瘤療法具有耐受性，且在臨床上不可治愈，因此迫切需要深入研究參與腫瘤轉(zhuǎn)移的內(nèi)在的分子機(jī)制。

microRNA（miRNA）是一類長約19-23nt的單鏈非編碼RNA，miRNA與其靶mRNA的3’-UTRs（3’非編碼區(qū)）特異性結(jié)合，引起靶mRNA的翻譯抑制或切割降解。miRNA直接作用于約30％的人類基因，而且?guī)缀鯀⑴c所有的生物過程，包括細(xì)胞生長、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、分化以及應(yīng)激反應(yīng)等。在過去的五年里，一系列參與調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移尤其是乳腺癌轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)的miRNA被發(fā)現(xiàn)，如miR-10b［1］，miR-335［2］，miR-373和 miR-520［3］。此外，miR-200和let-7家族也參與腫瘤的轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)［4-6］。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞發(fā)展具備轉(zhuǎn)移特性時，一系列的miRNAs的表達(dá)丟失，如 miR-335，miR-206，miR-126［2］，miR-31［7］，miR-340［8］等，而恢復(fù)其表達(dá)則抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，反之則會促進(jìn)轉(zhuǎn)移。

迄今為止，盡管多種miRNA的癌基因功能以及抑制腫瘤作用已經(jīng)被闡明，但是腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因和miRNA之間錯綜復(fù)雜的相互作用關(guān)系還沒有真正清楚，而且目前miRNA靶點治療還沒有獲得成功［9］。因此，通過誘導(dǎo)miRNA分子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，可以尋找新的抗腫瘤細(xì)胞生長和遷移的miRNA分子靶點，發(fā)現(xiàn)更多與乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA，從而為乳腺癌的治療提供新的思路。

我室購買了500種miRNA前體表達(dá)質(zhì)粒庫，因此可以進(jìn)行大規(guī)模的乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA篩選。目前，我們已經(jīng)通過向小鼠乳腺癌4TO7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA表達(dá)載體的方法，獲得50種穩(wěn)定表達(dá)miRNA的乳腺腫瘤細(xì)胞克隆，并比較了其中25種miRNA過表達(dá)對尾靜脈移植瘤生長的抑制或促進(jìn)作用，初步篩選得到一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制miRNA和一種腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)miRNA，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 鼠源m iRNA表達(dá)載體構(gòu)建及質(zhì)粒制備

鼠源 miRNA表達(dá)載體庫購自傲銳東源（OriGene Technologies），25條miRNA前體名稱及功能見表1（序列參見miRBase）攜帶SgfI和 MluI酶切位點，被克隆到pCMV-MIR載體的CMV啟動子下游。miRNA前體序列長度約600 bp，包含60-70 nt的pre-miRNA且攜帶上下游250-300 nt的側(cè)翼序列。經(jīng)測序并比對正確無突變堿基后，質(zhì)粒小提，醋酸鈉無水乙醇沉淀，質(zhì)粒終濃度達(dá)1μg/μL以上，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠乳腺癌細(xì)胞4TO7由實驗室凍存，用含10％胎牛血清（PAA）、100 IU/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素的 DMEM（GIBCO公司）培養(yǎng)基作為4TO7細(xì)胞的培養(yǎng)液，于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

采用脂質(zhì)體2000（Invitrogen公司）轉(zhuǎn)染4TO7細(xì)胞（具體轉(zhuǎn)染步驟參照脂質(zhì)體2000操作說明）。轉(zhuǎn)染后24 h，1∶10傳代，用含 500μg/mL G418 （AMRESCO公司）的培養(yǎng)液篩選細(xì)胞2周，倒置顯微鏡（Nikon TS100）下挑選綠色熒光克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀分選綠色熒光標(biāo)記穩(wěn)定表達(dá)MicroRNAs細(xì)胞，并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3 實驗動物

BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司SCXK（京）2007-0001，雌性，體重18～20 g，在本實驗室無特定病原體（specific-pathogen free，SPF）的飼養(yǎng)間（SYXK（京）2009-0003）飼養(yǎng)。所有實驗操作程序均經(jīng)過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號為ILAS-GC-2012-001）。

1.4 尾靜脈注射接種BALB/c小鼠

取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染空載體的4TO7細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)miRNA的4TO7細(xì)胞，分別調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106cells/mL。每只 BALB/c小鼠尾靜脈接種0.1 mL單細(xì)胞懸液。小鼠模型分兩組，每組3～6只。陰性對照組，轉(zhuǎn)染pCMV-MIR空載體；陽性組，轉(zhuǎn)染miRNA表達(dá)載體。

1.5 觀察尾靜脈移植瘤生長情況

接種14 d后犧牲動物，解剖分離肺組織，觀察腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移情況，計數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 25種m iRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

25條鼠源miRNA前體（表1）攜帶SgfI和MluI酶切位點，被克隆到pCMV-MIR載體的CMV啟動子下游（圖1），在轉(zhuǎn)染過程中，細(xì)胞內(nèi)將以CMV啟動子驅(qū)動miRNA前體表達(dá)為成熟miRNA，發(fā)揮其相應(yīng)的細(xì)胞學(xué)功能性。這些miRNA前體根據(jù)其功能及與腫瘤的關(guān)系密切程度可以分為三類：已經(jīng)被實驗驗證與癌癥關(guān)系密切的7種miRNA分子如mir-133a-1、mir-148a、mir-24-2、mir-375、mir-376、mir-421、mir-449a；與癌癥關(guān)系未知的12種miRNA分子如mir-1-2-as、mir-466d、mir-467e、mir-487b、mir-546、mir-568、mir-654、mir-668、mir-682、mir-692-2、mir-763、mir-764等；還有最近新發(fā)現(xiàn)的6種miRNA分子包括mir-1193、mir-1895、mir-1902、mir-1931、mir-1935、mir-1940等。

2.2 25種m iRNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立

經(jīng)過轉(zhuǎn)染，G418篩選結(jié)合流式細(xì)胞儀分選獲得表達(dá)25種miRNA的混合細(xì)胞克隆，經(jīng)過多次傳代熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，miRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的形態(tài)、生長方式、生長速度等與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細(xì)胞無明顯差異。將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)用于BALB/c小鼠尾靜脈注射。其對照細(xì)胞及三類 miRNA的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（彩插5圖2）。

圖1 miRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

表1 25種鼠源microRNAs及涉及腫瘤Tab.1 25 mousemicroRNAs and related cancer

2.3 m iRNA過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞系尾靜脈移植瘤生長的調(diào)節(jié)

2.3.1 23種miRNA過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移無明顯的抑制或者促進(jìn)作用

將對數(shù)生長期的穩(wěn)定表達(dá)miRNA的4TO7細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)對照載體的4TO7細(xì)胞分別對BALB/c小鼠進(jìn)行尾靜脈接種。14 d后，脫頸處死，解剖取材，統(tǒng)計肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，陽性組的小鼠肺組織結(jié)節(jié)數(shù)目沒有明顯的增加或者減少，因此這些miRNA過表達(dá)對腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移無明顯的抑制或者促進(jìn)作用（圖3）。

圖3 23種miRNA對乳腺癌肺轉(zhuǎn)移無明顯的抑制或者促進(jìn)作用Note：A-X were 4To7（n=6）、mir-1193（n=3）、mir1-2-as（n=5）、mir-133a-1（n=3）、mir-148a（n=6）、mir-1895（n=4）、mir-1902 （n=3）、mir-1931（n=6）、mir-1940（n=6）、mir-24-2（n=6）、mir-375（n=6）、mir-376a（n=6）、mir-421（n=5）、mir-466d（n=5）、mir-467e（n=6）、mir-487b（n=6）、mir-546（n=6）、mir-568（n= 3）、mir-654（n=6）、mir-668（n=3）、mir-682（n=6）、mir-692-2（n =6）、mir-763（n=3）and mir-764（n=6）.Fig.3 Twenty-threemicroRNAs neither inhibited nor promoted lungmetastases of breast cancer

2.3.2 mir-449a抑制尾靜脈移植瘤生長

將對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染陰性對照載體的4TO7細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)mir-449a的4TO7細(xì)胞分別對BALB/c小鼠進(jìn)行尾靜脈接種。14 d后，脫頸處死，解剖取材，統(tǒng)計肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，陽性組即接種表達(dá)mir-449a的乳腺腫瘤細(xì)胞的小鼠肺組織結(jié)節(jié)數(shù)目顯著減少，轉(zhuǎn)移程度降低（圖4）。

圖4 mir-449a過表達(dá)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移Note：A，Tail vein xenografted tumors of control cells and cells expressing mir-449a； B，The number of metastasis foci in the lungs from mice inoculated with mir-449a-expressing 4To7 cells via tail vein was significantly decreased compared with mice inoculated with negative control cells.Fig.4 mir-449a over-expression inhibited tumor cellmetastasis

2.3.3 miR1935促進(jìn)尾靜脈移植瘤生長

將對數(shù)生長期的穩(wěn)定表達(dá)miR-1935的4TO7細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)陰性對照載體的4TO7細(xì)胞分別對BALB/c小鼠進(jìn)行尾靜脈接種。14 d后，脫頸處死，解剖取材，統(tǒng)計肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，陽性組即接種表達(dá)mir-1935的乳腺腫瘤細(xì)胞的小鼠肺組織結(jié)節(jié)數(shù)目顯著增多，轉(zhuǎn)移程度增加（圖5）。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特性之一，腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及抗腫瘤的實驗研究不可能完全利用人體活檢和尸檢材料去完成，必須建立相應(yīng)的動物及人類腫瘤動物轉(zhuǎn)移模型，特別是小鼠模型，這對研究腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制是極其重要的工具和手段。腫瘤轉(zhuǎn)移動物模型按轉(zhuǎn)移途徑可分為血道腫瘤轉(zhuǎn)移動物模型和淋巴道腫瘤轉(zhuǎn)移動物模型。按轉(zhuǎn)移程度還可分為高轉(zhuǎn)移腫瘤轉(zhuǎn)移動物模型（轉(zhuǎn)移率超過70％）和低轉(zhuǎn)移腫瘤轉(zhuǎn)移動物模型（轉(zhuǎn)移率低于30％）。李小穎等［21］對三株熒光素酶標(biāo)記的小鼠乳腺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長及轉(zhuǎn)移進(jìn)行比較，研究發(fā)現(xiàn)來源于BALB/cfC3H小鼠自發(fā)乳腺癌細(xì)胞株的4TO7細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力中等，尾靜脈注射14 d，在肺部可見較多腫瘤結(jié)節(jié)或者轉(zhuǎn)移灶，同時不會因腫瘤結(jié)節(jié)過多導(dǎo)致動物死亡，可作為研究腫瘤轉(zhuǎn)移的理想細(xì)胞模型。因此，本研究選擇轉(zhuǎn)移能力中等的4TO7細(xì)胞通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)多種鼠源miRNA表達(dá)，考察不同的miRNA的表達(dá)是否對4TO7細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性改變發(fā)生影響。

圖5 mir-1935過表達(dá)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移Note：A，Tail vein xenografted tumors of control cells and cells expressingmir-1935；B，The number ofmetastasis foci in the lungs from mice inoculated with mir-1935-expressing 4To7 cells via tail vein was significantly increased compared with mice inoculated with negative control cells.Fig.5 mir-1935 over-expression accelerated tumor cellmetastasis

目前，已經(jīng)有超過1000種人類miRNA被發(fā)現(xiàn)。miRNAs參與多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等。一些miRNAs在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，其中一些miRNA抑制腫瘤發(fā)生，稱為tumor suppressor miRNA（TSmiRs）；另一些 miRNA促進(jìn)腫瘤發(fā)生，則稱作 oncogenic miRNAs，即oncomiRs。Tavazoie SF等［2］發(fā)現(xiàn)miR-335、miR-126和miR-206具有腫瘤轉(zhuǎn)移抑制能力，其中miR-126能夠影響細(xì)胞的運動和增殖。miR-335則通過抑制轉(zhuǎn)錄因子SOX4的表達(dá)抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。由此可見，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的miRNA是重要和多能的，而且 miRNA復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個miRNA來調(diào)控多個基因的表達(dá)，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細(xì)調(diào)控某個基因的表達(dá)。因此TSmiRs分子具有十分重要的臨床使用價值，發(fā)現(xiàn)更多與乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA，將為乳腺癌的治療提供更多新的靶點。

mir-449a在多種固體腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中低水平表達(dá)，包括前列腺癌，胃癌，脾癌和肺癌［16-20］。Noonan等［16］報道m(xù)iR-449a在前列腺癌中低表達(dá)，從而導(dǎo)致了前列腺癌細(xì)胞中組蛋白脫乙酰基酶-1 （histone deacetylases，HDAC-1）過表達(dá)，而HDAC-1是一種原癌基因。這暗示了mir-449a可能是一種抑癌基因，其表達(dá)異?？赡芘c癌癥發(fā)生有關(guān)。羅等［20］報道m(xù)ir-449a在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低生存率相關(guān)，在體外實驗中可以通過c-Met靶點抑制腫瘤遷移和侵襲。迄今為止，還沒有mir-449a與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的報道。本研究中，mir-449a過表達(dá)的4TO7細(xì)胞，和對照細(xì)胞相比，尾靜脈注射產(chǎn)生肺部轉(zhuǎn)移的能力下降，提示mir-449a對乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移具有抑制作用。與之功能相反的是mir-1935，在本報道中表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，目前國際上還沒有類似的報道，也缺少對其功能的預(yù)測，因此有關(guān)其腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)機(jī)制還需深入的研究。

綜上所述，本研究首次通過尾靜脈移植瘤小鼠模型對鼠源miRNA過表達(dá)對乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的影響作用進(jìn)行較大規(guī)模篩選，并已經(jīng)獲得初步進(jìn)展。從25種鼠源miRNA中篩選到2種與乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA：mir-449a抑制尾靜脈移植瘤生長，mir1935促進(jìn)尾靜脈移植瘤生長。其余23種鼠源miRNA對小鼠乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移無明顯的促進(jìn)或者抑制作用。未來我們將繼續(xù)展開工作，以期獲得更多參與乳腺癌轉(zhuǎn)移過程的miRNA。miRNA療法將有可能成為治療乳腺癌的有效方式，關(guān)于miRNA新功能的研究，將為乳腺癌的治療開啟一扇新的大門，為乳腺癌患者帶來希望。

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［21］李小穎，馬元武，張連峰.三株熒光素酶標(biāo)記的小鼠乳腺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長及轉(zhuǎn)移的比較［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（4）：1-4

The study of screening breast tumor suppressor m icroRNA in m ice

ZHANG Li，LIXiao-ying，SUN Cai-xian，ZHANG Xu，Chen Wei，ZHANG Lian-feng
（Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College（PUMC），Beijing 100021，China）

Objective To investigate the functional role of 25 microRNAs in breast cancer，and to find new tumor suppressor microRNAs that may serve as specific targets of new gene therapies. M ethods Twenty-five microRNAs expression vectors were constructed and stably transfected into mouse mammary tumor cells 4To7 by Lipofectamine2000.Cells were selected with G418 and sorted by Flow cytometry.The cells in logarithmic phase were collected and 2×105cells/mouse was inoculated into BALB/cmice via tail vein.Lungswere harvested 14 days after tumor cell inoculation，and the number ofmetastasis fociwas counted.Results Mice inoculated with mir-449a-expressing 4To7 cells via tail vein developed reduced lungmetastases compared with mice inoculated with negative control cells.Mice inoculated with mir-1935-expressing 4To7 cells via tail vein developed increased lung metastases compared with mice inoculated with negative control cells.Other twenty-threemicroRNAs neither promoted nor inhibited lungmetastases of breast cancer.Conclusions Two of twenty-fivemicroRNA were identified to be associated with breast cancermetastasis.MiR-449amay play a tumour suppressor role in the regulation of migration and metastasis in breast cancer.miR-1935 transgenic over-expression promoted tumor growth and metastasis.

4TO7；Breast cancer；Micro RNA；Metastasis；Tail intravenous injection

張連峰，E-mail：Zhanglf@cnilas.org。

R332

A

1671-7856（2014）03-0072-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.015

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項課題“嚙齒類研發(fā)平臺創(chuàng)新藥物研究開發(fā)技術(shù)平臺建設(shè)”（2011ZX09307-302）；國家科技支撐計劃課題“神經(jīng)和代謝疾病基因工程模型的建立”（2012BAI39B02）。

張麗，女，博士，E-mail：zhangliqq2004@126.com。

2014-02-17

設(shè)施設(shè)備