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      瘦素基因敲除肥胖大鼠的血糖及病理長期觀察

      2014-05-10 12:22:03關(guān)菲菲孫彩顯張連峰
      中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2014年3期
      關(guān)鍵詞:胰島月齡空腹

      張 麗,關(guān)菲菲,張 旭,陳 煒,孫彩顯,張連峰

      (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

      瘦素基因敲除肥胖大鼠的血糖及病理長期觀察

      張 麗,關(guān)菲菲,張 旭,陳 煒,孫彩顯,張連峰

      (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

      目的 對Leptin基因敲除SD大鼠血糖變化及病理表型進(jìn)行長期分析,為使用該大鼠作為糖尿病和脂代謝模型積累數(shù)據(jù)。方法 western blot檢測Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠肝臟中Leptin的表達(dá)。利用稱量方法測定Leptin基因敲除的SD大鼠(Leptin-/-)1,3,6,8月齡的體重變化,利用穩(wěn)豪血糖儀采尾血測定1,3,6,8月齡Leptin-/-大鼠空腹血糖值。HE染色和免疫組織化學(xué)觀察Leptin-/-大鼠胰腺及肝臟的病理學(xué)變化。結(jié)果 Leptin-/-大鼠肝臟中表達(dá)變短的功能異常的Leptin蛋白。Leptin-/-大鼠從1月齡開始出現(xiàn)顯著的體重增加,8月齡時雌性體重為884 g,雄性體重可以達(dá)到1200 g,是野生SD大鼠的2倍。自1月齡起,Leptin-/-雌鼠的空腹血糖值顯著高于野生大鼠,在1月齡到6月齡之間差別明顯(40%~26%),到8月齡和野生大鼠恢復(fù)到近正常水平。8月齡Leptin-/-大鼠肝臟肝小葉中出現(xiàn)大量脂肪空泡,胰腺內(nèi)較多脂肪細(xì)胞浸潤、胰島數(shù)量明顯增多,體積增大,胰島素陽性β細(xì)胞增多。結(jié)論 Leptin-/-大鼠表型表現(xiàn)為肥胖,脂肪肝,胰島增生和早期高血糖。

      瘦素;基因敲除;空腹血糖;肥胖;大鼠

      瘦素(Leptin)是一個主要由白色脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)類激素[1],其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的瘦素受體結(jié)合能夠啟動調(diào)節(jié)攝食和機(jī)體能量平衡,當(dāng)瘦素缺失或者受體缺失,會導(dǎo)致肥胖發(fā)生[2]。

      美國杰克遜實驗室發(fā)現(xiàn)的一種隱性遺傳的Leptin自發(fā)突變小鼠(ob/ob)[3],表現(xiàn)為攝食過度、肥胖、葡萄糖耐受、高血漿胰島素水平、不孕不育,因此被廣泛地應(yīng)用于糖尿病、肥胖、心血管和代謝類疾病研究[4]。

      盡管大鼠是使用量僅次于小鼠的實驗動物,而且相對于小鼠,大鼠與人類的關(guān)系近了大約400~500萬年[5],其在生理、代謝、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面比小鼠有更好的表現(xiàn)[6]。然而,傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)受到大鼠的ES細(xì)胞全能性局限,而一度未能實現(xiàn)Leptin敲除大鼠的建立。隨著鋅指酶(ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)因子核酸酶(TALENs)等技術(shù)的不斷完善,使大鼠基因敲除實用化[7-9]。2012年,Serglo Valra等[10]利用ZFN技術(shù)獲得了一種Leptin敲除大鼠,是在該基因外顯子1和內(nèi)含子上發(fā)生了151個堿基片斷的缺失,Leptin蛋白無法正常表達(dá)。該純合子大鼠出現(xiàn)攝食增加,肥胖,血清中總膽固醇、高密度和低密度膽固醇顯著增加,有明顯的高胰島素血和糖耐受受損。

      我們利用TALENs技術(shù)建立了Leptin基因敲除的SD大鼠品系(Leptin-/-),并對年輕 Leptin -/-大鼠的體重、脂肪含量、糖代謝等進(jìn)行了初步分析報,發(fā)現(xiàn)4月齡的Leptin-/-大鼠已經(jīng)表現(xiàn)出肥胖、高胰島素血、高脂血和糖代謝異常[11]。雖然目前世界上幾個實驗室建立了Leptin-/-大鼠,但是一方面敲除的區(qū)域不同[10-11],另一方面,缺少對Leptin-/-大鼠長期病理生理變化的分析數(shù)據(jù),影響了Leptin-/-大鼠的作為肥胖、糖尿病等疾病模型的使用。本文對1~8月齡Leptin-/-大鼠及同窩瘦大鼠(Leptin+/+)的血糖變化及病理表型進(jìn)行了對比分析,為Leptin-/-大鼠作為肥胖、糖尿病等模型提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

      1 材料和方法

      1.1 動物

      Leptin-/-大鼠背景品系為SD,在本實驗室繁育(SCXK(京)2013-002),選擇基因敲除純合子Leptin-/-大鼠和同窩陰性大鼠(Leptin+/+)。雌鼠:Leptin+/+(n=5)和 Leptin-/-(n=5)各5只;雄鼠:Leptin+/+4只(n=4)和 Leptin -/-2只(n=2)。本實驗方案得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn),批準(zhǔn)號為ILAS-GC-2012-001。

      1.2 western blot檢測Leptin的表達(dá)

      提取Leptin-/-大鼠和同窩陰性Leptin+/+大鼠肝組織總蛋白,BCA法測定濃度,進(jìn)行 SDSPAGE凝膠電泳,將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到0.45μm硝酸纖維素膜上,置于5%的脫脂奶粉封閉液中,室溫1 h,加入TBST稀釋的兔抗Leptin多克隆抗體(1:500)(ab117751,Abcam,美國),4°C孵育過夜,用TBST洗膜三次,每次10 min。然后加入1:15000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG,室溫雜交1 h。采用HRP-GAPDH(康成生物,中國)作為內(nèi)參,將膜置于化學(xué)發(fā)光劑中,用X光膠片曝光、顯影及定影。

      1.3 體重測定

      從1月齡開始,分別于1、3、6、8月齡給待測大鼠稱重。

      1.4 空腹血糖測定

      分別于1、3、6、8月齡,待測大鼠禁食過夜(不禁水),次日上午八點采尾血穩(wěn)豪血糖儀測定血糖值。

      1.5 組織學(xué)觀察

      2%戊巴比妥鈉麻醉犧牲大鼠,打開腹腔取出胰腺及肝臟固定于10%中性福爾馬林中24 h,脫水,石蠟包埋及切片HE染色,抗胰島素(insulin)多克隆抗體行免疫組織化學(xué)(4590s,1:100,Cell signaling),切片用Scanscope病理切片掃描器(美國Aperio公司)掃描后觀察病理學(xué)變化。

      1.6 統(tǒng)計分析

      實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用Student’s t-tests分析處理數(shù)據(jù),P<0.05為有顯著性差異。

      2 結(jié)果

      2.1 Leptin-/-大鼠表現(xiàn)肥胖表型

      為了對Leptin-/-大鼠的肥胖水平進(jìn)行檢測,從出生后1月齡始至8月齡,測定Leptin+/+和Leptin-/-大鼠的體重,6月齡Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠體型比較(圖1A)。Western blot結(jié)果顯示,8月齡Leptin-/-大鼠肝臟中不表達(dá)正常的Leptin蛋白,Lepin由于C末端缺失了28個氨基酸[11]分子量變?。▓D1B)。從1月齡開始出現(xiàn)顯著的體重增加,1月齡Leptin-/-雌、雄鼠體重比同窩瘦大鼠(Leptin+/+)分別增加了27%和37%,到3月齡時 Leptin-/-雌、雄鼠體重比同窩瘦大鼠(Leptin+/+)增加了38%和39%,6月齡、8月齡時Leptin-/-雌鼠體重是同窩瘦大鼠(Leptin+/+)的2.3倍,6月齡、8月齡時Leptin-/-雄鼠的體重是同窩瘦大鼠(Leptin+/+)的1.8倍和2.0倍(圖1C和圖1D)。

      2.2 Leptin-/-大鼠空腹血糖值增高

      從出生后1月齡始至8月齡,測定Leptin+/+雌鼠和Leptin-/-雌鼠的空腹血糖值。Leptin-/-大鼠空腹血糖表現(xiàn)出隨月齡的變化(圖2),雌鼠自1月齡起,Leptin-/-大鼠的空腹血糖值就顯著高于Leptin+/+大鼠(40%),3月齡比Leptin+/+大鼠高33%,6月齡血糖降低但仍然比Leptin+/+大鼠高26%,8月齡時比野生大鼠高出11%,高血糖表型可以維持5個月以上。

      2.3 Leptin-/-大鼠肝臟病理

      取材4、8月齡雌性Leptin-/-大鼠及Leptin +/+大鼠肝臟固定,石蠟包埋及切片,HE染色觀察Leptin-/-大鼠肝臟病理學(xué)變化(彩插7圖3)。結(jié)果顯示,4月齡Leptin-/-大鼠與Leptin+/+大鼠相比,沒有明顯的病理變化,8月齡 Leptin-/-大鼠肝臟肝小葉中出現(xiàn)大量脂肪空泡,提示肝細(xì)胞脂肪變性。

      2.4 Leptin-/-大鼠胰島增生

      圖1 Leptin-/-大鼠表現(xiàn)肥胖Note:A,Pictures of a Leptin+/+(left)and a Leptin-/-(right)rat at 6 months of age.B,The protein expression levels in liver tissues were determined by western blot.C,Body weightwasmeasured over 8 months for Leptin+/+(n=5)and Leptin-/-(n=5)females.D,Body weightwasmeasured over 8 months for Leptin+/+(n=4),Leptin-/-(n=2)males.*,P<0.05 vs.controls.Fig.1 Leptin-/-rats are obese

      取材4、8月齡雌性Leptin-/-大鼠及Leptin +/+大鼠的胰腺組織固定,石蠟包埋及切片,HE染色觀察基因敲除大鼠胰腺病理學(xué)變化(彩插7圖4)。結(jié)果顯示,6月齡Leptin-/-大鼠與Leptin+/+大鼠相比,胰島體積增大,但是數(shù)量增多不明顯,且胰腺也沒有脂肪細(xì)胞浸潤,而8月齡Leptin-/-大鼠胰島數(shù)量明顯增多,體積增大更顯著,胰腺內(nèi)較多脂肪細(xì)胞浸潤,胰島形態(tài)由于快速擴(kuò)張而極不規(guī)則。胰島素抗體免疫組化顯示,4、8月齡Leptin -/-大鼠β細(xì)胞增多,胰島素分泌大大增加(彩插7圖4)。

      圖2 Leptin-/-基因敲除大鼠空腹血糖受損Note:Fasting blood glucose of female Leptin+/+(n=5)and Leptin-/-rats(n=5)at1,3,6,8 months of age.*,P <0.05 vs.controls.Fig.2 Leptin deficiency-induced impaired fasting blood glucose

      3 討論

      相對小鼠而言,大鼠在營養(yǎng)和代謝等方面更接近人類,而且積累的生理學(xué)數(shù)據(jù)更多[12]。大鼠的內(nèi)分泌腺容易手術(shù)摘除,常用于研究各種腺體對全身生理生化功能的調(diào)節(jié);激素腺體和靶器官的相互作用;激素對生殖生理功能的影響,如發(fā)情、排卵、胚胎著床等的調(diào)控作用。還有自發(fā)或誘發(fā)性內(nèi)分泌功能失調(diào)造成的疾病模型,如:糖尿病、甲狀腺功能低下、甲狀旁腺功能低下、尿崩癥等的大鼠模型。大鼠還是營養(yǎng)學(xué)研究的重要動物,大量維生素A、B、C和蛋白質(zhì)缺乏等營養(yǎng)代謝研究,還常作氨基酸和鈣、磷代謝研究。基于大鼠在內(nèi)分泌、代謝等疾病模型方面的研究優(yōu)勢,建立Leptin基因敲除大鼠模型,可以為營養(yǎng)、代謝類疾病研究提供更優(yōu)良的動物模型。

      糖尿病前期是介于糖尿病和正常血糖之間的一種狀態(tài),被認(rèn)為是糖尿病的必經(jīng)階段,是糖尿病的預(yù)警信號[13-16]。糖尿病前期時,糖調(diào)節(jié)已受損,包括空腹血糖受損(IFG)和葡萄糖耐量減退(IGT)。對人類而言,其中空腹血糖受損是指空腹血糖高于正常且又低于糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)(在6.1~7.0 mmol/L之間)[17]。Sighild Westman[18-20]報道ob/ob小鼠自1月齡血糖高于野生瘦小鼠,2~3月齡期間持續(xù)升高,4~7月齡之間血糖下降,7月齡時和野生組沒有差異。因此,ob/ob小鼠可以作為一種糖尿病前期模型[4,18]。本研究中Leptin-/-大鼠空腹血糖值從1月齡起就高于野生大鼠,2~3月齡期間血糖持續(xù)升高,4~8月齡時血糖下降,8月齡時仍然比野生大鼠高出11%,因此Leptin-/-大鼠也可以作為一種前期糖尿病模型,而且由于大鼠Leptin-/-的高血糖維持時間要比ob/ob小鼠更長,在作為糖尿病模型方面將更具優(yōu)勢。

      Westman[21]發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠存活期間,胰島β細(xì)胞不斷增殖,胰島素釋放能力居高不下,并不發(fā)展成不可代償?shù)摩录?xì)胞損傷。但也跟遺傳背景相關(guān),如KsJob小鼠有胰島功能損傷和脂毒性胰島損傷[22],而在6J背景下卻沒有[23]。本研究中Leptin -/-大鼠超背景為SD,胰島病理觀察發(fā)現(xiàn),4月齡Leptin-/-大鼠胰島體積增大,數(shù)量增多不明顯,而8月齡 Leptin-/-大鼠胰腺內(nèi)胰島數(shù)量明顯增多,體積增大,胰島素陽性β細(xì)胞增多。結(jié)果提示,Leptin-/-大鼠胰島增生,胰島素分泌不斷增加以應(yīng)答血糖升高。因此,Leptin-/-大鼠可以作為一種胰島β細(xì)胞增殖與功能研究模型。

      Mathur等[24]發(fā)現(xiàn)瘦素抵抗的肥胖小鼠的胰腺脂肪浸潤程度高于對照組,說明肥胖與胰腺脂肪浸潤存在相關(guān)性。另一方面,脂肪胰還與代謝綜合征相關(guān),Tushuizen等[25]測量了脂肪胰患者空腹和餐后的血糖及血清胰島素水平,發(fā)現(xiàn)脂肪胰患者的胰島β細(xì)胞功能較健康對照者顯著下降。推測胰島周圍的脂肪細(xì)胞可能會影響胰腺內(nèi)胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),隨后誘發(fā)胰島細(xì)胞的壞死和脂肪組織替代。Leptin-/-大鼠具有脂肪肝和脂肪胰表型,可以作為一個模型系統(tǒng)用于脂肪肝和脂肪胰疾病研究。

      綜上所述,本研究中Leptin-/-大鼠1月齡起表現(xiàn)肥胖,8月齡時體重可以達(dá)到野生鼠的2倍左右,8月齡時肝臟可發(fā)展為脂肪肝,胰腺內(nèi)胰島增生、β細(xì)胞增多,胰島素分泌增加。大鼠壽命比小鼠長,且發(fā)病慢,持續(xù)時間長,因此該基因敲除大鼠可以成為肝臟脂肪毒性、胰島β細(xì)胞功能、早期糖尿病和肥胖等研究的更好的工具動物模型。

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      Long-time observation of blood glucose and pathological phenotype of leptin knockout obese rats

      ZHANG Li,GUAN Fei-fei,ZHANG Xu,CHENWei,SUN Cai-xian,ZHANG Lian-feng
      (Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine,Ministry of Health;Institute of Laboratory Animal Science,Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)&Comparative Medicine Centre,Peking Union Medical College(PUMC),Beijing 100021,China)

      Objective To obtain more physiological data of Leptin knockout SD rats available for the user,the long-term observation of fasting blood glucose and pathological phenotypes were performed.M ethods The protein expression levels in liver tissueswere determined by western blot.Body weight of Leptin knockout rats(Leptin-/-)and littermate lean rats(Leptin+/+)were weighed up at1,3,6,8 months of age.Fasting blood glucose of Leptin+/+rats and Leptin-/-rats at 1,3,6,8 months of age were measured using One Touch? brand blood glucose monitoring systems.Pathological changes of pancreas and livers of Leptin-/-ratswere observed by themethod of HE staining and Immunohistochemistry(IHC).Results Short null Lepin proteins were expressed in liver tissues from Leptin-/-rats.Leptin-/-rats become heavier than Leptin+/+rats since they were one month old.The body weight of Leptin-/-rats at8 months of age was twice as heavy as Leptin+/+rats,female Leptin-/-ratsweighing 884g,and male Leptin -/-ratsweighing 1200g.Overthyperglycemiawas observed during the firstmonth after birth.Compared with Leptin+/+female rats,the fasting blood glucose of Leptin-/-female ratswas increased by 40%-26%from 1 to 6 months old.After that,blood glucose values decreased and eventually become nearly normal at 8 months of age.Pathological examination indicated that Leptin-/-rats at8months of age had a fatty liver,more pancreas isletswith lager volume and more beta cells with increased insulin secretion.Conclusion Leptin-/-ratwere characterized by obesity,fatty liver,islet cell hyperplasia and early hyperglycemia.

      Leptin;Knock out;Fasting blood glucose;Obesity;Rat

      R332

      A

      1671-7856(2014)03-0045-05

      10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.010

      國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項課題“嚙齒類研發(fā)平臺創(chuàng)新藥物研究開發(fā)技術(shù)平臺建設(shè)”(2011ZX09307-302);國家科技支撐計劃課題“神經(jīng)和代謝疾病基因工程模型的建立”(2012BAI39B02).

      張麗,女,博士,E-mail:zhangliqq2004@126.com。

      張連峰,E-mail:Zhanglf@cnilas.org。

      2014-02-14

      研究報告

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