王文淵，張航航，周振華，2，楊春華，張蕓蘭

(1.湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南永州 425100;2.中南大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410013)

竹葉中含有竹葉黃酮、茶多酚、多糖、特種氨基酸以及活性肽、錳、鋅、曬等微量元素。竹葉茶多酚、黃酮和竹葉多糖具有抗氧化、抗衰老、防輻射、抗癌變、增強(qiáng)免疫力、降血脂和膽固醇、抗動脈硬化以及抑菌等多種生理功能和作用［1］，是醫(yī)藥、食品、保健品及日化用品等優(yōu)質(zhì)安全的基料或功能性添加劑［2］，應(yīng)用前景廣闊，竹葉也因此被國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)列入藥食兩用的天然植物名單。

從竹葉中提取這些活性成分，目前大都采用溶劑浸提、超聲提取或超臨界萃取等方法，但這些方法存在原料利用率低、生產(chǎn)周期長、能耗高或溶劑殘留等問題，妨礙了竹葉中各種功能性成分的高效開發(fā)與利用。高壓脈沖電場技術(shù)作為一種高效節(jié)能的非熱處理技術(shù)，通過細(xì)胞膜穿孔效應(yīng)來增大細(xì)胞膜的通透性，從而促進(jìn)生物活性成分的滲出，具有溫升小、能耗低、傳遞快速、均勻、安全等特點。

本文采用高壓脈沖電場技術(shù)，成功地從竹葉中同步提取了竹葉黃酮、竹葉茶多酚和竹葉多糖3種活性成分，為充分利用竹葉中的生物活性成分，實現(xiàn)竹葉資源的綜合利用和效益最大化提供指導(dǎo)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

竹葉，自采，經(jīng)永州市藥檢所王明榮教授鑒定為楠竹葉，采后漂洗晾干、烘干、粉碎，過250 μm篩后于4℃冷藏備用;蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所);葡萄糖對照品(上海士鋒生物科技公司);其他試劑均為分析純。

LDT-100/4-25型中藥高壓脈沖電場提取裝置;SY-MU2010超濾/微濾系統(tǒng);FZ-102微型中草藥植物粉碎機(jī);2-16PK高速冷凍離心機(jī);UV1601-PC紫外-可見分光光度計;M-50真空抽濾器。

1.2 實驗方法

竹葉中竹葉黃酮、多酚和多糖的提取工藝見圖1。

圖1 竹葉黃酮、多酚和多糖的提取工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram on extraction

1.3 分析方法

茶多酚的測定采用 GB 8313—1987方法［3］，總黃酮含量的測定按文獻(xiàn)［4］的方法，多糖的測定采用文獻(xiàn)［5］的方法。各提取成分的提取率按下式計算:提取率=(提取成分的質(zhì)量/竹葉粉末質(zhì)量)×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 電場強(qiáng)度對提取率的影響［6］

在脈沖數(shù)為8，料液比1∶12(g/mL)，EDTA緩沖液pH 8.5的條件下，電場強(qiáng)度對竹葉黃酮、茶多酚與多糖提取率的影響見圖2。

圖2 電場強(qiáng)度對竹葉黃酮、茶多酚和多糖提取率的影響Fig.2 Influence of electric field intensity on extraction

由圖2可知，當(dāng)脈沖電場強(qiáng)度從12 kV/cm增加到24 kV/cm時，竹葉黃酮、茶多酚和多糖的提取率均逐漸增大，這是因為電場強(qiáng)度增強(qiáng)，細(xì)胞膜的通透性提高，活性成分釋放能力增強(qiáng)。電場強(qiáng)度超過24 kV/cm后，黃酮提取率趨于穩(wěn)定，說明細(xì)胞膜、細(xì)胞壁已經(jīng)被不可逆擊穿，黃酮類成分滲出趨于完全，而茶多酚和多糖的提取率開始有所下降。因此電場強(qiáng)度選定24 kV/cm較為適宜。

2.2 EDTA緩沖液pH對提取率的影響［7］

在脈沖數(shù)為8，料液比1∶12(g/mL)，電場強(qiáng)度24 kV/cm，改變提取介質(zhì)EDTA緩沖液的pH，進(jìn)行高壓脈沖電場提取，測定竹葉黃酮、茶多酚與多糖的提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 緩沖液pH、茶多酚和多糖提取率的影響Fig.3 Influence of buffer solution pH on extraction

由圖3可知，緩沖液pH從5.0提高至9.0時，竹葉黃酮、茶多酚與多糖的提取率均隨緩沖液pH的增大而增加。竹葉茶多酚和竹葉多糖的提取率分別在pH 8.0和9.0處達(dá)到最大值，竹葉黃酮的提取率在pH 9.0之后仍呈上升趨勢，但增加緩慢。故EDTA緩沖液的pH選擇8.0～9.0。

2.3 料液比對提取率的影響

在脈沖數(shù)為8，電場強(qiáng)度24 kV/cm，緩沖液pH 8.5的條件下，料液比對竹葉黃酮、茶多酚與多糖提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對竹葉黃酮、茶多酚和多糖提取率的影響Fig.4 Influence of solid/liquid ratio on extraction

由圖4可知，竹葉黃酮、茶多酚與多糖的提取率均隨著料液比的增大而提高，料液比超過1∶16，竹葉黃酮與竹葉茶多酚的提取率緩慢攀升;因為竹葉多糖的溶出性能較好，料液比達(dá)到1∶12時，提取率已趨于穩(wěn)定，所以料液比以1∶12～1∶16為宜。

2.4 脈沖數(shù)對提取率的影響［8］

在電場強(qiáng)度24 kV/cm，EDTA緩沖液pH 8.5，料液比1∶14(g/mL)的條件下，脈沖數(shù)對竹葉黃酮、茶多酚與多糖提取率的影響見圖5。

圖5 脈沖數(shù)對竹葉黃酮、茶多酚和多糖提取率的影響Fig.5 Influence of pulse number on extraction

由圖5可知，脈沖數(shù)由2增至8時，竹葉黃酮的提取率快速提高并達(dá)到最大值，而茶多酚提取率在脈沖數(shù)為10時達(dá)到最大，之后隨著脈沖數(shù)的進(jìn)一步增大，黃酮與茶多酚的提取率都開始減小。這可能是脈沖頻率太大，容易導(dǎo)致被提取物結(jié)構(gòu)的破壞，從而使得提取率降低［9］。但竹葉多糖的提取率一直隨著脈沖數(shù)的增大呈上升趨勢，脈沖數(shù)＞10時，提取率提高緩慢。綜合考慮，脈沖數(shù)以8～10個為宜。

2.5 正交實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，對電場強(qiáng)度、脈沖數(shù)、緩沖液pH、料液比4個因素進(jìn)行L9(34)正交實驗，水平設(shè)計及實驗結(jié)果見表1。

表1 正交實驗結(jié)果Table 1 Results of L9(34)orthogonal test

續(xù)表

由表1可知，影響黃酮提取率的因素主次為電場強(qiáng)度＞料液比＞緩沖液pH＞脈沖數(shù)，提取黃酮的工藝以A3B3C3D3組合最佳;影響多糖提取的各因素主次為電場強(qiáng)度＞緩沖液pH＞料液比＞脈沖數(shù)，提取多糖條件以A3B2C3D3組合最佳;影響茶多酚提取的各因素主次順序為電場強(qiáng)度＞緩沖液pH＞脈沖數(shù)＞料液比，提取茶多酚以A3B3C2D3組合工藝最優(yōu);各因素對提取總量的影響大小依次為電場強(qiáng)度＞緩沖液pH＞料液比＞脈沖數(shù)，從提取總量出發(fā)，提取工藝以A3B2C3D3組合最佳?？墒侵袢~黃酮、茶多酚和多糖以及總提取率的最佳提取條件在9個實驗號中都未出現(xiàn)，故于各自的最佳組合工藝條件下進(jìn)行3次平行實驗，取平均值，結(jié)果見表2。

表2 最佳組合工藝條件下的實驗結(jié)果Table 2 Results under optimum condition combination process

由表2可知，按各自的最佳工藝進(jìn)行提取，竹葉黃酮、多糖和茶多酚的提取率以及總提取率均比正交實驗中最優(yōu)值高。因此，可以確定高壓脈沖電場提取竹葉中各活性成分的最優(yōu)工藝條件。提取黃酮的最優(yōu)工藝是電場強(qiáng)度26 kV/cm，脈沖數(shù)10個，料液比1∶16(g/mL)，緩沖液pH 9.0;提取多糖的最優(yōu)工藝是電場強(qiáng)度26 kV/cm，脈沖數(shù)9個，料液比1∶16(g/mL)，緩沖液pH 9.0;提取竹葉茶多酚的最優(yōu)工藝是電場強(qiáng)度26 kV/cm，脈沖數(shù)10個，料液比1 ∶14(g/mL)，緩沖液 pH 9.0。

表3 總提取率的方差分析Table 3 Variance analysis for orthogonal test

由表3可知，電場強(qiáng)度、EDTA緩沖液pH和料液比對總提取率均有顯著影響，而脈沖數(shù)無顯著影響，從能耗和成本考慮，脈沖數(shù)可取B1水平。因此，從提取總量來考慮，最佳提取工藝是A3B1C3D3，即電場強(qiáng)度26 kV/cm，脈沖數(shù)8個，料液比1∶16(g/mL)，緩沖液 pH 9.0。

2.6 與傳統(tǒng)水浸提法的比較

高壓脈沖電場法與傳統(tǒng)水浸提法單獨(dú)提取竹葉多糖、乙醇超聲浸提茶多酚［10］、微波輔助提取竹葉黃酮［11］比較，竹葉黃酮與竹葉多糖的提取率分別提高了25.1%和31.6%，但竹葉多酚的提取率則降低了2.4%，這與王白娟等［12］的實驗結(jié)果趨于一致，原因是酚酸類成分經(jīng)過高壓脈沖電場處理，部分結(jié)構(gòu)破壞，致使有小部分的損失。

3 結(jié)論

高壓脈沖電場法提取竹葉黃酮、竹葉茶多酚與竹葉多糖，各成分提取的最優(yōu)工藝條件是:黃酮:電場強(qiáng)度26 kV/cm，脈沖數(shù)10個，料液比1∶16，緩沖液pH 9.0;多糖:電場強(qiáng)度26 kV/cm，脈沖數(shù)9個，料液比1∶16，緩沖液 pH 9.0;茶多酚:電場強(qiáng)度26 kV/cm，脈沖數(shù)10個，料液比1∶14，緩沖液 pH 9.0;提取總量:電場強(qiáng)度26 kV/cm，脈沖數(shù)8個，料液比1 ∶16，緩沖液pH 9.0。

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