程靜靜，陳 莉，李朝飛，陳冠軍，鮑瑩瑩，魯云霞

（安徽醫(yī)科大學(xué)1.生物化學(xué)教研室、2.化學(xué)教研室，安徽合肥 230032；3.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽合肥 230022）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)膜型／分泌型蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞器，在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)正確折疊、鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用，是維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要細(xì)胞器，葡萄糖、病毒感染、化學(xué)藥物如衣霉素等多種刺激因素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊／錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）和鈣穩(wěn)態(tài)失衡等狀態(tài)被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）［1］。過度的ERS是一系列疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和腎功能障礙等的誘因之一。

隨著肥胖人群在全球范圍內(nèi)的增多，與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的代謝綜合征也日益增多，血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化的起始步驟，其早期病變是內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［2］。白藜蘆醇（resveratrol，RES）屬于一種非黃酮類多酚化合物，存在于多種植物中，具有抗自由基、抗脂質(zhì)過氧化作用，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的防治起重要的作用［3－4］，但尚無其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中影響ERS的相關(guān)報(bào)道。已知氧化應(yīng)激和ERS之間相互聯(lián)系，一方面氧化應(yīng)激干擾ER中的蛋白質(zhì)折疊，另一方面UPR可引起氧化應(yīng)激，因此推測RES的抗氧化作用可能減少UPR和ERS［5］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究RES對(duì)高脂飲食小鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮及細(xì)胞的影響是否與ERS有關(guān)。由于RES是天然無毒化合物，作用較緩慢，因此參照文獻(xiàn)選取單一的較高劑量 RES（400 mg·kg－1·d－1）［6］，體外實(shí)驗(yàn)先用不同濃度的RES預(yù)孵育，再用一定濃度的棕櫚酸誘導(dǎo)，以觀察其保護(hù)作用是否具有劑量效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 C57BL／6小鼠24只，8周齡，清潔級(jí)，♂，體質(zhì)量20～25 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（mouse aortic endothelial cells，MAEC），由合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院劉健博士饋贈(zèng)。

1.1.2 藥物和試劑 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用白藜蘆醇購自南京澤朗醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)有限公司；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用白藜蘆醇（R5010）、棕櫚酸（palmitic acid，PA）購自美國Sigma公司，四季青胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；RNAStore樣品保存液（DP408）購自天根生化科技（北京）有限公司；RT試劑盒購自Fermentus Life Sciences；DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；鼠抗3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體購自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；兔抗GRP78多克隆抗體購自美國 Abcam公司；鼠抗CHOP單克隆抗體購自美國CST公司；兔抗eNOS多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體和DAB均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；FITC羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒（ECL發(fā)光劑）購自碧云天生物技術(shù)研究所；DAPI購自Biosharp生物科技有限公司；RIPA裂解液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。所有引物均用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物技術(shù)工程有限公司合成（Tab 1）。

Tab 1 Primer sequences used for RT-PCR analysis of related gene expression in m ice

1.1.3 動(dòng)物分組及用藥 將C57 BL／6小鼠隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)飲食組（SCD）、高熱量高膽固醇飲食組（HCD，20%豬油、20%蔗糖、10%蛋黃粉、1%膽固醇）和高熱量高膽固醇飲食＋白藜蘆醇組（HCD＋RES）。除SCD組外，其余2組均為HCD喂養(yǎng)，HCD＋RES組在HCD的同時(shí)灌胃白藜蘆醇（400 mg·kg－1·d－1）治療12周。所有操作均遵守安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

1.2 方法

1.2.1 胸主動(dòng)脈的病理學(xué)檢測和免疫組織化學(xué)分析 小鼠處死后迅速取出胸主動(dòng)脈，用4%（V／V）的多聚甲醛溶液固定72 h，石蠟包埋，4μm切片，HE染色和間苯二酚品紅染色，400倍光鏡下觀察組織的病理學(xué)改變，對(duì)比拍照。將血管以4μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗后用山羊血清封閉，eNOS羊抗兔（1∶100）4℃過夜，二抗工作液室溫孵育10 min，辣根酶標(biāo)記鏈卵白素標(biāo)記，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。

1.2.2 胸主動(dòng)脈的 RT-PCR分析 抽提血管總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，常規(guī)PCR分析，反應(yīng)條件為：預(yù)變性 94℃3 min，變性 94℃30 s、退火 55℃30 s、延伸72℃ 30 s，32個(gè)循環(huán)后 72℃延伸 5 min，3%瓊脂糖凝膠電泳，以目的條帶的灰度與內(nèi)參GAPDH的灰度之比表示目的基因的表達(dá)水平。

1.2.3 MAEC細(xì)胞培養(yǎng) 將MAEC細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，種植在含10%胎牛血清、105IU·L－1青霉素、105IU·L－1鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、95%濕度的條件下培養(yǎng)，2～3 d換液1次。待細(xì)胞生長至單層融合狀態(tài)后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，低濃度 RES（10μmol·L－1）、中濃度 RES（50μmol·L－1）、高濃度 RES（100μmol·L－1）預(yù)處理6 h后加入0.5 mmol·L－1PA孵育，每組平行6個(gè)復(fù)孔，重復(fù) 3次，培養(yǎng)時(shí)間分別為 6、12、18、24 h，在達(dá)各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)前4 h時(shí)，每孔加5 g·L－1MTT 20μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除培養(yǎng)基，每孔加150μl DMSO，酶標(biāo)儀測定OD570。

1.2.5 Western blot 不同濃度 RES預(yù)處理后加PA共同孵育24 h，RIPA裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后分別用抗GAPDH（1∶800）、GRP78（1∶600）的一抗4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，加入 ECL發(fā)光劑反應(yīng)5～10 min，暗室顯影成像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光 制備細(xì)胞爬片，不同濃度RES預(yù)處理后加PA共同孵育24 h，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100破膜，5%BSA封閉后加鼠抗CHOP單克隆抗體（1∶200）4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC山羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h，DAPI染色10 min后抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 細(xì)胞免疫組化分析 制備細(xì)胞爬片，不同濃度RES預(yù)處理后加PA共同孵育24 h，4%多聚甲醛固定，其余步驟包括eNOS的濃度均同上述組織的免疫化學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)高脂飲食小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞病理學(xué)的影響 HE及間苯二酚染色結(jié)果顯示：SCD組小鼠動(dòng)脈結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)光滑完整，彈力纖維排列呈波浪狀，未見斷裂，無病理學(xué)改變；HCD組動(dòng)脈管壁增厚，彈力纖維排列紊亂，局部有斷裂現(xiàn)象；HCD＋RES組相對(duì)于HCD組管壁變薄，彈力纖維基本無斷裂（Fig 1）。

2.2 白藜蘆醇對(duì)胸主動(dòng)脈ERS中3個(gè)上游通路分子基因表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示：與SCD組相比，HCD組小鼠胸主動(dòng)脈的ERS中3個(gè)信號(hào)通路IRE1α、ATF6以及PERK的基因水平表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）；與 HCD組相比，HCD＋RES組PERK、IRE1α基因水平明顯降低（P＜0.05），ATF6基因的表達(dá)差異無顯著性（P＞0.05）。

2.3 白藜蘆醇對(duì)胸主動(dòng)脈ERS中2個(gè)下游分子GRP78和CHOP基因表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果表明：與SCD組相比，HCD組小鼠胸主動(dòng)脈的ERS中GRP78和CHOP基因的表達(dá)均明顯增加（P＜0.05）；與HCD組相比，HCD＋RES組CHOP基因的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），GRP78雖然略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見 Fig 3。

2.4 白藜蘆醇對(duì)胸主動(dòng)脈eNOS蛋白水平表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示：eNOS蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)；與SCD組相比，HCD組eNOS的表達(dá)降低；與HCD組相比，HCD＋RES組的eNOS表達(dá)有所增加（Fig 4）。

Fig 1 Photom icrographs ofmouse thoracic aorta w ith HE and resorcinol-fuchsin staining（×400）A.SCD group；B.HCD group；C.HCD＋RES group.1：HE staining；2：resorcinol-fuchsin staining.

Fig 2 Comparison ofmRNA expression of IRE1α，ATF6 and PERK in thoracic aorta of 3 groups*P＜0.05 vs SCD group；＃P＜0.05 vs HCD group

2.5 白藜蘆醇對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)MAEC增殖的影響由Tab 2可知：PA對(duì)MAEC增殖有明顯的抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴關(guān)系；RES預(yù)處理后，可改善PA對(duì)MAEC增殖的抑制作用，其中低濃度（10 μmol·L－1）RES對(duì) MAEC改善增殖作用不明顯（P＞0.05），較高濃度作用12 h以上明顯增強(qiáng)（P＜0.05），且呈濃度依賴性。

Tab 2 Influence of RES pretreatment on proliferation of mouse aortic endothelial cells treated w ith PA（±s，n＝3）

Tab 2 Influence of RES pretreatment on proliferation of mouse aortic endothelial cells treated w ith PA（±s，n＝3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs PA

Group 6 h 12 h 18 h 24 h NC 0.652±0.013 0.685±0.014 0.874±0.016 0.921±0.011 PA 0.543±0.021*0.565±0.016*0.665±0.015**0.636±0.014**RES10μmol·L－1 0.572±0.011 0.599±0.029 0.697±0.011 0.701±0.021＃RES50μmol·L－1 0.591±0.012＃ 0.644±0.021＃ 0.767±0.024＃ 0.782±0.012＃RES100μmol·L－1 0.607±0.025＃ 0.664±0.021＃ 0.841±0.012＃＃ 0.851±0.019＃＃

Fig 3 Com parison ofm RNA expression of CHOP and GRP78 in thoracic aorta of 3 groups*P＜0.05 vs SCD group；＃P＜0.05 vs HCD group

Fig 4 The immunohistochem ical results of eNOS in thoracic aorta of 3 groups（×400）A：SCD group；B：HCD group；C：HCD＋RES group.

2.6 白藜蘆醇對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)M AEC中GRP78蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果表明：與NC組相比，PA組MAEC表達(dá)的GRP78蛋白水平均明顯升高（P＜0.05）；單獨(dú)使用RES組對(duì)GRP78表達(dá)沒有明顯影響（P＞0.05）；不同濃度RES干預(yù)后GRP78的蛋白水平表達(dá)相對(duì)于PA組明顯降低（P＜0.05）（Fig 5）。

Fig 5 Effect of RES pretreatment on expression of GRP78 protein induced by PA in MAEC*P＜0.05 vs NC group；＃P＜0.05 vs PA group

2.7 白藜蘆醇對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)MAEC中CHOP蛋白表達(dá)的影響 與NC組相比，PA組CHOP表達(dá)明顯增加，且定位在細(xì)胞核；與PA組相比，中、高劑量RES干預(yù)組CHOP表達(dá)明顯減少，而低濃度RES組與PA組相比，CHOP的減少不明顯（Fig 6）。

2.8 白藜蘆醇對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)MAEC中eNOS蛋白表達(dá)的影響 eNOS主要在胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)。與NC組相比，PA組eNOS表達(dá)明顯減少；與PA組相比，低濃度RES預(yù)處理后，eNOS蛋白表達(dá)無明顯增加，中、高濃度RES預(yù)處理后，eNOS蛋白表達(dá)明顯增加（Fig 7）。

Fig 6 Effect of RES pretreatment on expression of CHOP protein induced by PA in MAECs

Fig 7 Effects of RES pretreatment on expression of eNOS protein induced by PA in MAECsA：NC group；B：0.5 mmol·L－1 PA group；C：10μmol·L－1 RES＋0.5 mmol·L－1 PA group；D：50μmol·L－1 RES＋0.5 mmol·L－1 PA group；E：100μmol·L－1 RES＋0.5 mmol·L－1 PA group.

3 討論

UPR有3個(gè)主要的效應(yīng)蛋白：ATF6、IRE1α和PERK，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，這3個(gè)效應(yīng)蛋白都與分子伴侶GRP78結(jié)合，當(dāng)發(fā)生 ERS時(shí)，它們與GRP78分離，然后被激活［7］。錢磊等［2］研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食或者PA誘導(dǎo)時(shí)胸主動(dòng)脈或內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生ERS。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠高熱量高膽固醇飲食12周后，胸主動(dòng)脈組織彈力纖維排列紊亂，ERS相關(guān)基因水平明顯升高，表明該飲食明顯激活內(nèi)皮細(xì)胞的ERS通路；白藜蘆醇干預(yù)后，血管內(nèi)皮中PERK、IRE1α及下游CHOP、GRP78基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，提示白藜蘆醇保護(hù)高脂損傷大血管的作用機(jī)制可能與其緩解 ERS、降低 PERK、IRE1α及其下游 CHOP、GRP78的基因表達(dá)有關(guān)。另有研究表明白藜蘆醇可抑制缺血／再灌注和衣霉素誘導(dǎo)的ERS及視網(wǎng)膜血管變性［8］，并通過抑制GRP78蛋白的表達(dá)從而減少ERS和糖尿病大鼠的早期腎損害［9］，與本文的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。

高脂飲食后小鼠血清中16碳的軟脂酸（PA）和18碳的硬脂酸均升高，以PA升高最為明顯［10］，因此本研究先通過低、中、高劑量的白藜蘆醇預(yù)處理MAEC，然后用 PA（0.5 mmol·L－1）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中、高濃度白藜蘆醇（50、100μmol·L－1）可明顯改善PA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系（Tab 2）。PA可明顯增加GRP78、CHOP的蛋白表達(dá)，中、高濃度白藜蘆醇則明顯減少PA誘導(dǎo)的ERS。有報(bào)道稱白藜蘆醇可抑制乙醇誘導(dǎo)的ERS及Caspase-12，導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡［11］，也可在HepG2細(xì)胞中通過誘導(dǎo)去乙酰化酶SIRT1的高表達(dá)來誘導(dǎo)氧調(diào)節(jié)蛋白150（ORP150）的表達(dá)以減緩PA誘導(dǎo)的ERS和胰島素抵抗［12］，與本文的細(xì)胞研究結(jié)果基本一致。

NO主要由eNOS催化生成后分泌到血液，參與調(diào)控血管擴(kuò)張、免疫反應(yīng)等多種生理和病理學(xué)過程［13］。在糖尿病早期階段，由eNOS表達(dá)改變引起的NO水平異常會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生［14］，白藜蘆醇可通過上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS的表達(dá)來發(fā)揮其血管保護(hù)作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)［16］，高脂飲食導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)減少，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)PA可抑制eNOS的表達(dá)，而動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明白藜蘆醇的干預(yù)或預(yù)處理可增加eNOS的表達(dá)（Fig 4、6），提示高脂飲食和PA誘導(dǎo)的小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞受損與eNOS的表達(dá)減少密切相關(guān)，而白藜蘆醇可能通過增加eNOS的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。白藜蘆醇是SIRT1的特異性激動(dòng)劑，研究表明在肝細(xì)胞中，Exedin-4通過增加SIRT1的表達(dá)來減緩ERS標(biāo)志基因的表達(dá)，本研究將在后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)觀察白藜蘆醇是否也能以類似的方式來減少ERS標(biāo)志基因的表達(dá)。

綜上所述，本研究從體內(nèi)和體外兩方面證實(shí)了白藜蘆醇對(duì)高熱量高膽固醇飲食和棕櫚酸誘導(dǎo)胸主動(dòng)脈及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，可能與其明顯減少ERS和增加eNOS的表達(dá)有關(guān)。然而白藜蘆醇具體如何影響ERS下游的通路，進(jìn)而改變eNOS的表達(dá)、影響血管的舒張功能？以及其對(duì)ERS的影響是直接作用還是間接作用？需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)，其機(jī)制的闡明將為開發(fā)白藜蘆醇作為以ERS及其下游PERK、IRE1α等為靶點(diǎn)的藥物提供理論依據(jù)。

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