羅蕭蕭，趙以林，李世勇，譚蕾，王金韜

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院，武漢 430030)

·藥物研究·

氯胺酮通過MEF2信號通路調(diào)節(jié)發(fā)育期神經(jīng)元突觸生長及突觸重塑*

羅蕭蕭，趙以林，李世勇，譚蕾，王金韜

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院，武漢 430030)

目的 探討氯胺酮不同暴露時間下對發(fā)育神經(jīng)元肌細(xì)胞增強因子2(MEF2)信號通路及突觸生長相關(guān)蛋白synapsin I表達(dá)影響。方法新生5 d齡SD大鼠,隨機(jī)分為2,4,6和24 h氯胺酮組(T組)和對照組(C組)。將新生5 d SD大鼠皮下注射氯胺酮(20 mg·kg-1)干預(yù)。對照組不做任何處理。干預(yù)后在各對應(yīng)時間點提取海馬神經(jīng)元總RNA,利用real-time PCR進(jìn)行定量分析MEF2信號通路(MEF2 mRNA、synGAP I mRNA和Arc mRNA)及突觸形成相關(guān)基因synapsin I mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與C組相比,用氯胺酮干預(yù)后時間依賴性下調(diào)海馬神經(jīng)元MEF2 mRNA、synGAP I mRNA、Arc mRNA(P＜0.05)。Synapsin I mRNA表達(dá)則時間依賴性上調(diào)(P＜0.05)。麻醉后24 h恢復(fù)正常。結(jié)論氯胺酮短暫下調(diào)MEF2信號通路而上調(diào)synapsin I表達(dá),其機(jī)制可能是Arc表達(dá)上調(diào)增加突觸數(shù)目以致synapsin I表達(dá)上調(diào)。

氯胺酮；海馬；發(fā)育期神經(jīng)元；肌細(xì)胞增強因子2；突觸素

在神經(jīng)元發(fā)育過程中,軸突的分化生長以及突觸聯(lián)系形成是神經(jīng)系統(tǒng)功能得以體現(xiàn)的基礎(chǔ)及記憶形成的關(guān)鍵步驟,而突觸素在神經(jīng)元突起的生長、突觸的形成以及突觸的維持中發(fā)揮重要作用[1-2]。發(fā)育期神經(jīng)元是軸突生長和突出形成的重要階段,特別容易受到外界因素干擾如氯胺酮等。肌細(xì)胞增強因子2 (myocyte enhancer factor 2,MEF2)作為鈣依賴性調(diào)節(jié)因子,在神經(jīng)系統(tǒng)突觸發(fā)育和分化中發(fā)揮著重要的作用,特別是下游基因synGAP和Arc在調(diào)控突觸形成過程中起著重要作用[3-4]。筆者在本研究探討氯胺酮對發(fā)育期神經(jīng)元突觸素的表達(dá)與MEF2信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司,批號:D6110A)；Trizol試劑(上海華舜公司,批號: WR202)；實時定量PCR試劑盒(日本Takara公司,批號:DRRO81S)；BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀(德國Ependorf公司)；ABI實時熒光定量PCR儀(美國Life Technologies公司)；氯胺酮注射劑(福建吉田藥業(yè)有限公司,規(guī)格:2 mL∶100 mg,批號:H35010148)。

1.2 動物選擇及分組 出生5 d的Sprague-Dawley (SD)大鼠30只,雌雄不拘,體質(zhì)量10～13 g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。利用隨機(jī)數(shù)字表將實驗動物分為5組(n=6):對照組(C組)、氯胺酮2 h組、氯胺酮4 h組、氯胺酮6 h組和氯胺酮24 h組,其中氯胺酮各時間點組統(tǒng)稱為T組。將新生5 d SD大鼠皮下單次注射氯胺酮(20 mg·kg-1)干預(yù)而對照組不做任何處理。麻醉期間低濃度給氧(氧流量2 L·min-1),35℃干預(yù)。麻醉后,在相應(yīng)時間點斷頭提取海馬組織的總mRNA。

1.3 實時熒光定量PCR 用Trizol試劑盒提取各組海馬組織的總RNA,按實時定量RT-PCR試劑盒說明書取500 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后用熒光標(biāo)記物SYBR GreenI在ABI熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。在同一反應(yīng)體系內(nèi)對MEF2、Arc、synGAP I、synapsin I mRNA和內(nèi)參照β-actin mRNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR引物為:MEF2(NM_001014035.1)上游引物為5′-ACG GCA CAC AGA GCA CC TTG-3′,下游引物為5′-CTA GGT TTC TGC AGG CTA ATG TGGA-3′, PCR產(chǎn)物片斷為133 bp；Arc(ID:54323)上游引物為5′-GCA CAT AAA CCA TGA CCC ATA CT-3′,下游引物為5′-GCT GGA TAT TGA AGG CTT GG-3′,PCR產(chǎn)物片斷為111 bp；synGAP I(NM_001113409.1)上游引物為5′-TGT CCG CTG ACA TCG AGA GTG-3′,下游引物為5′-AGC TTC CGG TTG GAC ATG TGT AG-3′, PCR產(chǎn)物片斷為157 bp；synapsin I(NM_019133)上游引物為5′-TCT GA CCA ATG CCT TCA ACC TTC-3′,下游引物為5′-CTG CGG ATG GTC TCA GCT TTC-3′, PCR產(chǎn)物片斷為87 bp。β-actin(NM_031144)上游引物為5′-TGA CAG GAT GCA GAA GGA GA-3′下游引物為5′-TAG AGC CAC CAA TCC ACA CA-3′,PCR產(chǎn)物片斷為104 bp。擴(kuò)增參數(shù):94℃變性5 s,60℃退火及延伸30 s,共反應(yīng)40個循環(huán),分析融解曲線。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮對發(fā)育期大鼠海馬MEF2信號通路的影響 發(fā)育期大鼠海馬MEF2 mRNA在氯胺酮麻醉2 h時表達(dá)開始下調(diào)(t=3.83,P＜0.05),4 h時表達(dá)最低(t=3.07,P＜0.05)；Arc mRNA(t=3.58,P＜0.05)和synGAP I mRNA(t=3.52,P＜0.05)在氯胺酮處理6 h時表達(dá)最低(P＜0.05)。于麻醉后24 h時3種基因mRNA水平表達(dá)恢復(fù)正常。見表1。故氯胺酮可短暫下調(diào)發(fā)育期大鼠海馬MEF2信號通路。

2.2 氯胺酮對發(fā)育期大鼠海馬synapsin I mRNA表達(dá)的影響 synapsin I mRNA麻醉4 h時表達(dá)開始上調(diào)(t=-3.28,P＜0.05),6 h時表達(dá)達(dá)到高峰(t=-2.77,P＜0.05)。于麻醉后24 h時基因synapsin I mRNA水平表達(dá)恢復(fù)正常。見表2。故氯胺酮可上調(diào)發(fā)育期大鼠海馬synapsin I mRNA表達(dá)。

3 討論

氯胺酮具有鎮(zhèn)痛作用顯著而呼吸抑制作用較輕的特點,多用于小兒麻醉。研究證實氯胺酮作為N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體非選擇性阻斷藥,可引起發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)退行性變。其機(jī)制可能是氯胺酮阻斷NMDA受體,可抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流,抑制鈣/鈣調(diào)蛋白(Ca2+/CaM)的依賴信號途徑,從而抑制環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)和MEF2多種信號通路轉(zhuǎn)錄[5]。突觸形成期為大腦快速發(fā)育期,而NMDA受體活性是神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育期神經(jīng)元生長及突觸重塑所必需。由于突觸形成期神經(jīng)元對各種麻醉藥最為敏感,發(fā)育期大鼠神經(jīng)元發(fā)育高峰期為出生后第1～7 d,一般認(rèn)為第5天是神經(jīng)元發(fā)育的高峰期并開始形成功能性突觸連接[6-7]。因此筆者采用5 d齡乳鼠來源的海馬神經(jīng)元,用作發(fā)育期海馬神經(jīng)元來探討氯胺酮對突觸生長和突觸重塑的影響。

表1 兩組大鼠各時間點海馬MEF2 mRNA、synGAP I mRNA、Arc mRNA表達(dá)水平的比較Tab.1 Comparison of the mRNA expression of MEF2,synGAP I and Arc in hippocampal neurons between two groups at each time point n=3,±s

表1 兩組大鼠各時間點海馬MEF2 mRNA、synGAP I mRNA、Arc mRNA表達(dá)水平的比較Tab.1 Comparison of the mRNA expression of MEF2,synGAP I and Arc in hippocampal neurons between two groups at each time point n=3,±s

與C組同時間點比較,*1P＜0.05Compared with C group at same time point,*1P＜0.05

組別與時間MEF2 mRNAsynGAP I mRNAArc mRNA組別與時間MEF2 mRNAsynGAP I mRNAArc mRNA T組C組2 h0.69±0.09*10.76±0.07*10.70±0.14*12 h1.01±0.101.03±0.050.99±0.09 4 h0.52±0.13*10.61±0.12*10.55±0.21*14 h1.01±0.121.03±0.091.02±0.17 6 h0.66±0.14*10.57±0.17*10.48±0.22*16 h0.99±0.130.98±0.100.98±0.10 24 h1.03±0.041.03±0.190.96±0.08 24 h1.02±0.091.01±0.110.97±0.06

表2 兩組大鼠各時間點海馬synapsin I mRNA表達(dá)水平的比較Tab.2 Comparison of synapsin I mRNA expression in hippocampal neurons between two groups at each time point n=3,±s

表2 兩組大鼠各時間點海馬synapsin I mRNA表達(dá)水平的比較Tab.2 Comparison of synapsin I mRNA expression in hippocampal neurons between two groups at each time point n=3,±s

與C組同時間點比較,*1P＜0.05Compared with C group at same time point,*1P＜0.05

組別2 h4 h6 h24 h T組1.29±0.341.90±0.47*12.46±0.91*11.18±0.57 C組1.06±0.210.96±0.140.99±0.140.98±0.05

MEF2是一種特定的轉(zhuǎn)錄因子,因其涉及基因調(diào)節(jié)不同環(huán)節(jié)及其控制多種基因表達(dá),正日益受到高度重視[3-4]。目前發(fā)現(xiàn)MEF2在發(fā)育期神經(jīng)元中是調(diào)節(jié)突觸生長和突觸重塑的重要信號通路。在發(fā)育期中樞神經(jīng)系統(tǒng),MEF2的激活負(fù)調(diào)控興奮性突觸密度。MEF2激活依賴于細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流。鈣離子通過NMDA和電壓依賴性鈣通道(voltage-dependentcalcium channels,VDCCs)內(nèi)流,激活鈣/鈣調(diào)蛋白(Ca2+/CaM)的依賴信號途徑。然后刺激鈣調(diào)磷酸酶(也稱為蛋白磷酸酶2B)去磷酸化MEF2的蛋白質(zhì)上一些磷酸化位點,包括對MEF2A的和MEF2D(分別抑制Ser408和Ser444),以促進(jìn)MEF2的活化。當(dāng)MEF2被激活,促進(jìn)了其一系列下游基因轉(zhuǎn)錄,包括Arc和synGAP[8]。研究證實Arc是調(diào)控發(fā)育期海馬神經(jīng)元的突觸數(shù)目重要基因[3-4]。因此本研究旨在探討氯胺酮對MEF2信號通路及其下游基因的表達(dá)的影響。

Synapsin I是特異性位于軸突末梢的突觸前膜上,是一種重要的膜標(biāo)記蛋白。Synapsin I在發(fā)育期神經(jīng)元生長及突觸重塑方面起著非常重要的作用,它參與乙酰膽堿、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程。在發(fā)育期神經(jīng)元軸突生長過程中synapsin I調(diào)控著軸突分支數(shù)目。有研究認(rèn)為,synapsin I一方面通過對突觸結(jié)構(gòu)的影響,另一方面通過其磷酸化作用調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,從而在突觸可塑性中起一定作用[1-2]。筆者研究證實氯胺酮可以上調(diào)發(fā)育期海馬神經(jīng)元synapsin I表達(dá),這說明氯胺酮可能增加軸突分支的數(shù)目有關(guān)。

本研究結(jié)果表明,發(fā)育期大鼠海馬MEF2 mRNA、synGAP I mRNA和Arc mRNA在氯胺酮麻醉處理后短暫表達(dá)下調(diào),說明氯胺酮能夠抑制MEF2信號通路。氯胺酮麻醉處理后發(fā)育期大鼠海馬synapsin I表達(dá)都短暫上調(diào),說明氯胺酮增強對synapsin I表達(dá)。

綜上所述,氯胺酮可短暫下調(diào)MEF2信號通路(MEF2 mRNA、synGAP I mRNA和Arc mRNA)的表達(dá),且上調(diào)海馬突觸形成相關(guān)基因synapsin I表達(dá)。在氯胺酮作用下MEF2信號通路對synapsin I表達(dá)的調(diào)節(jié)關(guān)系,還需進(jìn)一步實驗證實。

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DOI 10.3870/yydb.2014.04.002

Effects of Ktamine on Transcriptional Factor MEF2 Signaling Pathway and Expression of Synaptogenesis Synapsin I of Rat Developing Hippocampal Neurons in vivo

LUO Xiao-xiao,ZHAO Yi-lin,LI Shi-yong,TAN Lei,WANG Jin-tao
(The Second Clinical College of Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To investigate the time-dependent effects of ketamine on myocyte enhancer factor 2(MEF2) signaling pathway and expression of synaptogenesis synapsin I of rat developing hippocampal neuronsin vivo.MethodsForty 5-day-old rats were randomly divided into 4 treatment groups receiving ketamine(20 mg·kg-1)single injection and a control group receiving no treatment.Pups were killed by decapitation to extract total RNA from hippocampal neurons in the 4 treatment groups at 2,4,6,24 h,respectively,and from the control group.Real-time-PCR was used to detect the expression of the MEF2 mRNA、synGAP I mRNA and Arc mRNA and synapsin I mRNA after intervention.ResultsCompared with the control group, there are significant decreases in the expression of MEF2 mRNA,synGAP I mRNA,Arc mRNA and increase in synapsin I mRNA of the neurons from ketamine treatment groups(P＜0.05).ConclusionThe mechanism of ketamine-induced decrease in expression of MEF2 signaling pathway and increase in the expression of synapsin I may be related to decreased expression of Arc signaling pathway,which in turn regulates the expression of snapsin I in the developing hippocampal neurons.

Ketamine;Hippocampus;Developing neuron;Myocyte enhancer factor 2;Synapsin I

R971.2;R965

A

1004-0781(2014)04-0419-03

2013-05-02

2013-10-25

*國家自然科學(xué)基金資助項目(81200880)

羅蕭蕭(1992-),女,湖北武漢人,學(xué)士,研究方向:麻醉藥理。電話:(0)13507122565,E-mail：asd2007asd@126.com。

趙以林(1982-),男,山東日照人,醫(yī)師,博士,研究方向:麻醉毒理。電話:(0)13871469616,E-mail：yilinzhao001@163.com。