譚 妍，沈國林，莊笑梅，李 樺，高 月

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院1.毒物藥物研究所、2.放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

四物湯是中醫(yī)經(jīng)典良方，見于宋代《太平惠民和劑局方》，是治療血虛證的首選藥，由熟地、當(dāng)歸、白芍和川芎4味藥組成，臨床上用于補血、活血和調(diào)經(jīng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，它還具有調(diào)節(jié)心血管功能、抗放射線損傷、抗自由基損傷、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理學(xué)作用［1-2］。高月等［3-4］通過四物湯的方證結(jié)合研究以及分子中藥的組學(xué)研究，確定了四物湯促進(jìn)造血作用的主要效應(yīng)成分是果糖、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪，它們的藥理作用和動物藥代動力學(xué)已有報道［2，5］。

中藥復(fù)方具有多組分、多作用靶點的特點。配伍使用時，不同中藥的眾多成份間構(gòu)成了復(fù)雜的相互作用體系，包括藥效學(xué)和藥代動力學(xué)兩個層面上的相互作用，形成了復(fù)方整體效應(yīng)的重要基礎(chǔ)。細(xì)胞色素P450酶（CYP）是介導(dǎo)體內(nèi)藥物代謝清除的主要酶系，也是導(dǎo)致藥物代謝性相互作用的重要因素。研究中藥有效成分對CYP酶的抑制和誘導(dǎo)作用，對于代謝性相互作用的評價及其內(nèi)在機制的理解，具有重要意義［6］。我們的前期工作表明，CYP酶參與了四物湯主要效應(yīng)成分芍藥苷、川芎嗪和阿魏酸的代謝［7-8］。除了阿魏酸和川芎嗪對CYP酶的抑制或誘導(dǎo)作用已有初步研究外［6，9］，其他效應(yīng)成分及配伍對CYP酶的作用尚未見報道。為此，本文在體外人肝微粒體 （human liver microsome，HLM）和大鼠肝細(xì)胞孵育體系中，評價了四物湯效應(yīng)成分及其配伍對6個常見CYP同工酶的抑制和誘導(dǎo)活性，為從代謝角度解釋中藥方劑的配伍規(guī)律提供實驗資料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 果糖（批號：100231-200904）、阿魏酸（批號：110773-201012）、芍藥苷（批號：110736-201035）和川芎嗪（批號：110817-201006）標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國食品藥品檢定研究院。CYP1A和CYP3A的陽性誘導(dǎo)劑3-甲基膽蒽和苯巴比妥鈉、鹽酸普萘洛爾（內(nèi)標(biāo)）、CYP同工酶的特異性底物非那西?。–YP1A2）、安非他酮 （CYP2B6）、甲苯磺丁脲（CYP2C9）、S-美芬妥因（CYP2C19）和右美沙芬（CYP2D6）購自 Sigma公司；咪達(dá)唑侖（CYP3A4）、CYP同工酶的代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚（CYP1A2）均購自中國食品藥品檢定研究院；羥基安非他酮（CYP2B6）、4-羥基甲苯磺丁脲（CYP2C9）、4-羥基美芬妥因（CYP2C19）、右啡烷（CYP2D6）、1′-羥基咪達(dá)唑侖（CYP3A4）、混合人肝微粒體（蛋白含量20 g·L-1，批號34689）購自BD Gentest公司。肝細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco公司。甲醇（色譜純）和乙腈（色譜純）為Fisher公司產(chǎn)品。清潔級♂ SD大鼠，體質(zhì)量（220±20）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，動物許可證號 SCXK（軍）2007-004。UHPLCMS／MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)由Agilent UHPLC 1290液相色譜和Agilent6410B三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜組成，色譜柱為 Agilent ZORBAX SB C18柱（100 mm×3.0 mm，3.5μm）。

1.2 實驗分組 實驗分為藥物組和對照組，藥物組設(shè)置 15個組別（Tab 1），包括果糖（G）、阿魏酸（A）、芍藥苷（S）和川芎嗪（C）單藥組、兩藥組、三藥組和四藥組。

Tab 1 Experimental grouping for CYP inhibition and induction studies

1.3 大鼠原代肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 依據(jù)文獻(xiàn)，采用兩步灌流法分離并獲得大鼠原代肝細(xì)胞，“三明治”夾心法培養(yǎng)原代肝細(xì)胞［10］，肝細(xì)胞密度為109·L-1。

1.4 孵育條件 CYP酶抑制實驗：用pH 7.4的K2HPO4緩沖液配制總體積為250μl的反應(yīng)體系，其中含 NADPH再生系統(tǒng)（1 mmol·L-1NADP、5 mmol·L-16-磷酸葡萄糖、1 kU·L-16-磷酸葡萄糖脫氫酶和3.3 mmol·L-1氯化鎂），人肝微粒體0.2 g·L-1，CYP酶探針底物非那西?。?0μmol·L-1）、安非他酮（100μmol·L-1）、甲苯磺丁脲（120 μmol·L-1）、S-美芬妥因（40μmol·L-1）、右美沙芬（5μmol·L-1）和咪達(dá)唑侖（5μmol·L-1），系列濃度的陽性抑制劑或各實驗藥物。平行設(shè)置藥物組、陽性抑制劑組和陰性對照組。藥物組各成分的濃度為 0、0.15、0.5、1.5、5、10、50和 100μmol·L-1。參照本實驗室前期研究設(shè)置陽性抑制劑及其濃度范圍［11］：α-萘黃酮、奎尼丁和酮康唑的濃度為0、0.003、0.015、0.06、0.3、1.5和 6μmol·L-1；噻氯匹定為 0.015、0.05、0.15、0.5、1.5、5、10和 50 μmol·L-1；磺胺苯吡唑為 0、0.03、0.15、0.6、3、15和60μmol·L-1；反苯環(huán)丙胺為 0、0.3、1.5、6、30、150和600μmol·L-1，每組每個濃度3個復(fù)管。陰性對照組不加待測藥物或陽性抑制劑。將各組于37℃水浴中孵育30 min，加入沉淀劑250μl終止反應(yīng)，渦旋，13 800×g、4℃離心10 min，取上清進(jìn)樣分析，測定探針底物的產(chǎn)物生成量，計算相對酶活性和對應(yīng)的IC50。

CYP酶誘導(dǎo)實驗：實驗平行設(shè)置陰性對照組、陽性誘導(dǎo)劑對照組以及藥物組（Tab 1）。大鼠肝細(xì)胞來自3個供體，每組每個濃度2個復(fù)管。將分離得到的大鼠原代肝細(xì)胞用含實驗藥物（藥物分組同抑制實驗）或陽性誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h；誘導(dǎo)期結(jié)束后，洗去培養(yǎng)液，換用含探針底物咪達(dá)唑侖（CYP3A，10μmol·L-1）或非那西?。–YP1A，50 μmol·L-1）的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育1 h；孵育終點每孔取孵育液 200μl，用 200μl含內(nèi)標(biāo)的甲醇／乙腈（1∶1）終止反應(yīng)，13 800×g、4℃離心10min，取上清液進(jìn)樣分析，得到各探針底物的產(chǎn)物生成量，得到酶活性。藥物組各成分的終濃度為10、25和50 μmol·L-1，陽性誘導(dǎo)劑組 3-甲基膽蒽（CYP1A2）和苯巴比妥鈉（CYP3A1／2）的終濃度均為 1μmol·L-1和1 mmol·L-1，空白對照組的細(xì)胞孵育液不含藥物或陽性抑制劑。

1．5 HPLC-MS／MS條件 應(yīng)用本實驗室已建立的LC-MS-MS方法，定量檢測孵育體系中的6個探針代謝產(chǎn)物［11］。流動相A為含0.1%甲酸和5 mmol·L-1甲酸銨的純水，流動相B為含0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脫，內(nèi)標(biāo)為鹽酸普奈洛爾（50μg·L-1）。以ESI+源MRM方式進(jìn)行質(zhì)譜檢測，各代謝產(chǎn)物的反應(yīng)離子對為 m／z：152.1／110.1（對乙酰氨基酚，CYP1A2）、256.7／239.1（羥基安非他酮，CYP2B6）、287／171.1（4-羥 基 甲 苯 磺 丁 脲，CYP2C9）、235.2／150.1 （4-羥 基 美 芬 妥 因，CYP2C19）、258.2／157.1（右啡烷，CYP2D6）、342.1／324.1（1′-羥基咪達(dá)唑侖，CYP3A4）、260／116.2（鹽酸普萘洛爾，內(nèi)標(biāo)）。毛細(xì)管溫度300℃，毛細(xì)管電壓+4 000 V，霧化電壓172.375 kPa，干燥氣流速10 L·min-1。

1.6 數(shù)據(jù)處理 CYP酶抑制實驗：由探針底物代謝產(chǎn)物的生成量計算CYP酶的相對活性，由公式1計算不同濃度藥物作用下的相對酶活性Er：

式中，Ci（n）為不同藥物組濃度的代謝產(chǎn)物生成量，Ci（0）為空白對照組的代謝產(chǎn)物生成量。以相對酶活性Er為縱坐標(biāo)，藥物組濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，由GraphPad Prism 5軟件繪制抑制曲線并計算IC50值，以此來評價藥物對CYP酶的抑制作用。

對于IC50＞100μmol·L-1的藥物組，用抑制率評價其對CYP酶的抑制作用。由不同濃度藥物組的Ci（n）與空白組 Ci（0）的比值，計算 CYP酶的抑制率。

CYP酶誘導(dǎo)實驗：參考美國FDA推薦的酶誘導(dǎo)評價標(biāo)準(zhǔn)［12，17-18］，以受試藥組酶活性相對于空白對照組的提高≥陽性對照組酶活性提高的40%，為受試藥酶誘導(dǎo)作用的閾值。由公式2計算受試藥組相對于陽性組的誘導(dǎo)百分比Er.ind。

式中，Ctest、Ccontrol和 Cpos分別代表受試藥組、空白對照組和陽性對照組探針底物代謝產(chǎn)物生成量。統(tǒng)計學(xué)檢驗采用成組t檢驗進(jìn)行。

2 結(jié)果

2．1 CYP酶抑制活性評價 首先用已知的陽性抑制劑，驗證肝微粒體孵育體系。得到的陽性抑制劑IC50值均在文獻(xiàn)報道的范圍［13］，表明孵育體系滿足CYP酶抑制活性的評價要求。

在0.15～100μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，各單藥和配伍組對CYP3A4和CYP2D6的活性無影響。CYP1A2、2B6、2C9和2C19的酶活性隨藥物濃度增高呈現(xiàn)下降趨勢，但抑制作用很弱，在最高抑制濃度（100μmol·L-1）對人肝微粒體 CYP1A2、2B6、2C9和2C19的抑制率均＜62%。Tab 2展示了在100 μmol·L-1水平酶抑制率＞40%的藥物組結(jié)果。將各藥物組的剩余酶活性對對數(shù)抑制濃度作圖，得到的IC50值均＞100μmol·L-1，表明各單藥和配伍組對本研究測試的6個CYP同工酶活性無明顯的抑制作用。

Tab 2 Inhibitory effects of active components and their combinations on CYP isoforms at concentration of 100μmol·L-1

Tab 2 Inhibitory effects of active components and their combinations on CYP isoforms at concentration of 100μmol·L-1

*Inhibitory rate＜40%.

CYP isoform Inhibitory rate／%S+A S+A+C S+A+C+G CYP1A2 43.2±0.7 -*A C 42.9±0.6 55.2±0.9 45.3±2.1 CYP2B6 - - - 61.9±1.1 42.1±1.6 CYP2C9 44.5±1.6 40.6±2.1 55.6±1.5 42.5±1.0 -CYP2C19 59.2±1.7 53.3±2.3 51.1±1.3 43.1±0.8-

2．2 CYP酶誘導(dǎo)活性評價 將 CYP1A2和CYP3A1／2的陽性誘導(dǎo)劑3-甲基膽蒽和苯巴比妥鈉分別與“三明治”夾心培養(yǎng)大鼠肝原代細(xì)胞孵育72 h，與不加誘導(dǎo)劑的空白對照組相比，3-甲基膽蒽組酶活性的誘導(dǎo)倍數(shù)為11.8，苯巴比妥鈉組酶活性的誘導(dǎo)倍數(shù)為4.8，表明所建立的大鼠肝細(xì)胞誘導(dǎo)模型符合要求，可用于藥物 CYP酶誘導(dǎo)活性的評價［18］。

研究結(jié)果顯示，果糖、阿魏酸、芍藥苷、川芎嗪的單藥和配伍組，在不同濃度水平對大鼠肝細(xì)胞CYP3A1／2酶活性的提高均低于陽性誘導(dǎo)劑組的40%，表明4個單藥及其配伍對大鼠CYP3A酶無明顯的誘導(dǎo)作用。對于CYP1A2酶，芍藥苷的藥對和配伍組（S+A、S+C、S+A+C、S+A+G、S+C+G、S+A+C+G）在 25μmol·L-1和 50μmol·L-1濃度水平，對CYP1A酶活性的提高均大于陽性誘導(dǎo)組的40%（Fig1），顯示了酶誘導(dǎo)作用。芍藥苷單藥及其與果糖的藥對組（S和S+G）在50μmol·L-1時對CYP1A2也有一定的誘導(dǎo)作用。以芍藥苷單藥（S）及其與阿魏酸和川芎嗪的配伍組（S+A+C）為例，在50μmol·L-1時，兩組的CYP1A酶活性分別為空白對照組的4.4和10.2倍，酶活性的提高是陽性對照組的45.5%和86.6%（Tab3），表明芍藥苷與阿魏酸和川芎嗪合用對大鼠CYP1A酶有明顯的誘導(dǎo)作用。

Fig1 Inductioneffectsofactivecomponentsand theircombinationsonCYP1A2horizontalline：Cutoffvalueof40%ofpositivecontrol，NC：Negativecontrol，PC：positivecontrol.

3 討論

中藥復(fù)方按中醫(yī)理論和經(jīng)驗用藥，是中藥臨床應(yīng)用的主要形式，也是其特色和優(yōu)勢。中藥復(fù)方配伍使用時，多種有效成分之間構(gòu)成的相互作用體系，是中藥配伍整體效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的一部分。中藥有效成分之間、以及與其他中藥或西藥基于CYP酶抑制和誘導(dǎo)的相互作用，可以通過改變有效成分或合用藥物的藥代動力學(xué)行為，影響它們的藥理效應(yīng)或產(chǎn)生毒副作用［14-15］，這是中藥成分間相互作用和配伍的主要機制之一［16］。

Tab3 Inductioneffectsofpeoniflorinanditscombinationswith ferulicacidandligustrazinonCYP1A2inrathepatocyte

Tab3 Inductioneffectsofpeoniflorinanditscombinationswith ferulicacidandligustrazinonCYP1A2inrathepatocyte

*P＜0．05，**P＜0．01vsnegativecontrol.

Group Concentration／μmol·L-1 Relativeenzymeactivity／pmol·min-1·10-6cell Foldvsnegative control Er.ind／%Negativecontrol 0 1.9±0.2 1 -Positivecontrol 5 22.4±0.2** 11.8 100 S 10 4.6±1.0* 2.4 20.5 25 8.6±1.2** 4.6 38.4 50 10.2±0.4** 5.4 45.5 10 8.7±1.6** 4.6 38.8 S+A+C 25 15.4±1.9** 8.1 68.8 50 19.4±3.4**10.2 86.6

本研究在人肝微粒體和大鼠原代肝細(xì)胞試驗體系中，評價和分析了四物湯效應(yīng)成分單藥、藥對和多藥配伍組的CYP酶抑制和誘導(dǎo)作用。人肝微粒體的體外抑制結(jié)果表明，在濃度為0.15～100μmol·L-1時，四物湯各效應(yīng)成分、藥對及配伍對6個CYP同工酶均無明顯的抑制作用，它們在臨床上引起CYP抑制相互作用的可能性較小，體現(xiàn)了四物湯君臣佐使配伍在代謝酶抑制方面的完整性。

本研究以酶活性作為CYP酶誘導(dǎo)評價終點。由于體外肝細(xì)胞試驗與體內(nèi)肝臟的環(huán)境不同，藥物體外對肝細(xì)胞的作用與體內(nèi)給藥經(jīng)歷吸收、分布、排泄和代謝過程導(dǎo)致藥物濃度的差異，以及體外試驗因?qū)嶒灄l件的不同而結(jié)果差異較大等原因，使得肝細(xì)胞誘導(dǎo)評價結(jié)果的判斷相對困難。盡管與空白對照組相比，有些藥物能明顯提高肝細(xì)胞的酶活性，但在體內(nèi)不一定具有臨床意義的誘導(dǎo)作用。為此，美國FDA和制藥協(xié)會推薦用受試藥對酶活性的提高≥40%的陽性對照活性提高為閾值，以此判定受試物是否具有CYP酶誘導(dǎo)活性［12，17-18］。體外肝細(xì)胞誘導(dǎo)實驗的結(jié)果是否可被接受，還取決于陽性誘導(dǎo)劑的選擇及其對細(xì)胞的誘導(dǎo)能力。本研究分別選用大鼠CYP1A2和CYP3A1／2的特異性誘導(dǎo)劑3-甲基膽蒽和苯巴比妥［18］作為陽性對照，在大鼠肝細(xì)胞體系中，二者分別將 CYP1A2和3A1／2的活性提高11.8和4.8倍，表明孵育體系可用于受試藥的評價［18］。

本研究中，所有試驗組的相對酶活性與空白對照組相比，均有明顯提高（P＜0．05或P＜0.01），但根據(jù)40%陽性對照的閾值［12］，藥效成分單體中只有芍藥苷對CYP1A2表現(xiàn)出一定的誘導(dǎo)潛能，在50 μmol·L-1濃度水平，CYP1A2活性的提高為陽性組的45.5%；當(dāng)芍藥苷與阿魏酸、川芎嗪以不同形式配伍時，在25μmol·L-1濃度水平CYP1A2活性提高為陽性組的68.8%，4個藥效成分的配伍組（S+A+C+G）對 CYP1A2活性提高是陽性組的66.1%，表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)作用。高月教授課題組將四物湯各味中藥及配伍給大鼠連續(xù)服用14 d，考察體內(nèi)酶誘導(dǎo)作用，他們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有服用四物湯復(fù)方的大鼠組，CYP1A2酶的mRNA表達(dá)水平和酶活性明顯增高，提示四物湯各藥合用時，可上調(diào)CYP1A2的活性［18］，本研究的結(jié)果與大鼠體內(nèi)結(jié)果相符，同時從藥效成分的角度，解釋和四物湯CYP1A2酶誘導(dǎo)作用的分子基礎(chǔ)。體外肝細(xì)胞研究結(jié)果表明，芍藥苷可能是引起CYP1A2酶誘導(dǎo)的主要分子，其他藥效成分與其配伍可明顯提高酶誘導(dǎo)活性。

我們的前期研究表明，CYP3A4、2C8和2C9是代謝芍藥苷的主要CYP酶表型，CYP1A2酶參與了阿魏酸和川芎嗪的代謝，對阿魏酸和川芎嗪的CYP酶代謝的貢獻(xiàn)率分別約為30%和20%。還有研究還表明［19］，白芍在四物湯中有反佐作用。FA的CYP1A2酶誘導(dǎo)作用，以及復(fù)方合用時酶活性誘導(dǎo)的增強效應(yīng)，可能是其反佐作用的機制之一，CYP1A2酶的誘導(dǎo)會加快四物湯中阿魏酸和川芎嗪的代謝消除，減弱其藥理效應(yīng)［20］。

對中藥復(fù)方配伍規(guī)律的解釋歷來是個研究難題，本研究嘗試在體外試驗體系中，采用通用探針底物方法，評價四物湯效應(yīng)成分及配伍的CYP酶誘導(dǎo)和抑制作用，為從代謝角度闡明四物湯的配伍規(guī)律提供思路和實驗基礎(chǔ)。本研究得到的體外酶誘導(dǎo)結(jié)果及其臨床意義，還有待于在動物整體藥理學(xué)和藥代動力學(xué)試驗中進(jìn)一步的評價和研究。

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