安徽岳西茯苓醇提物高效液相指紋圖譜研究

張 穎

安徽中醫(yī)藥高專藥學系，安徽蕪湖，241000

茯苓為多孔菌科真菌茯苓（Poria cocs （Schw.）Wolf）的干燥菌核，具有利水消腫、健脾安神的療效［1］；茯苓多糖和茯苓酸還可用于抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫［2］。傳統(tǒng)的茯苓道地產(chǎn)區(qū)是大別山和云貴一帶，特別是云南茯苓“云苓”，被認為是所有產(chǎn)地中質(zhì)量最好的，現(xiàn)有文獻也多集中于云南茯苓的研究。安徽大別山一帶和湖北茯苓GAP種植基地是目前茯苓產(chǎn)量最大的產(chǎn)區(qū)，占全國產(chǎn)量七成以上。在文獻和前期研究的基礎上，筆者發(fā)現(xiàn)安徽岳西所產(chǎn)的茯苓藥材在外觀性狀和化學成分上與其他產(chǎn)地的茯苓有一些區(qū)別，如色澤、氣味，且當?shù)貍鹘y(tǒng)的用藥經(jīng)驗認為其質(zhì)量和療效優(yōu)于云苓。由于岳西茯苓具有獨特之處和優(yōu)良品質(zhì)，對岳西茯苓進行特征性鑒別的指紋圖譜研究具有一定必要性，且有關岳西茯苓質(zhì)量控制的研究未見報道。本研究收集了安徽岳西及其周邊一帶的茯苓藥材，采用HPLC法對其進行指紋圖譜的分析研究，建立了安徽岳西一帶茯苓的特征圖譜，探討了該區(qū)域茯苓藥材色譜學行為的獨特之處，為安徽岳西茯苓的鑒別和質(zhì)量控制提供了科學依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

E600型高效液相色譜儀為美國Waters公司生產(chǎn)；檢測器為waters 2489紫外可見光檢測器，也為美國Waters公司生產(chǎn)；FA21048型分析天平為上海越平儀器廠生產(chǎn)；ATM40－1B超聲波清洗機為蘇州愛拓瑪機械公司生產(chǎn)。

1.2 藥材

本實驗共收集了安徽省大別山一帶5個縣區(qū)13個批次的茯苓藥材，由安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校中藥教研室鑒定為多孔菌科真菌茯苓（Poria cocs（Schw.）Wolf）的干燥菌核（表1）。

表1 藥材采集信息

1.3 試劑

乙腈（色譜純，Merck公司）、磷酸（分析純，南京試劑一廠）；水為娃哈哈純凈水；對照品茯苓酸為上海純優(yōu)生物科技有限公司提供，批號201301P0734。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱為 waters symmetry C18（5μm，4.6＊150 mm）。檢測波長為243nm。流動相為乙腈和0.5%磷酸水溶液梯度洗脫［3］，洗脫條件如表2所示。

表2 HPLC梯度洗脫條件

2.2 對照品溶液的制備

取茯苓酸對照品適量，精密稱定，甲醇溶解后定容于10mL容量瓶中，即得濃度為0.13mg／mL的茯苓酸對照品溶液，微孔濾膜過濾，待用。

2.3 供試品溶液的制備

將茯苓藥材粉碎后，精密稱取0.5g，置適宜的圓底燒瓶中，定量加入甲醇50mL，稱定質(zhì)量后超聲提取30min，冷卻后補足損失重量，靜置后取上清液用0.45μm微孔濾膜濾過，待用。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取茯苓藥材（安徽岳西）1份，按既定方法制備溶液，并按既定方法分別在0、2、4、6、12、24h進樣分析，記錄各共有峰的峰面積和保留時間，通過分析，24h內(nèi)共有峰保留時間RSD值均小于0.82%，相對面積的RSD值均小于3.7%，實驗結果表明常溫下供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重現(xiàn)性試驗

取同一批茯苓藥材（安徽岳西）5份，按既定方法制備溶液，并按既定方法分別進樣20μL測定。計算各共有峰相對保留時間RSD值小于1.7%，相對峰面積RSD小于2.4%，實驗結果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6 精密度試驗

取茯苓藥材（安徽岳西）1份，按既定方法制備溶液，并按既定方法平行測定6次。計算各共有峰相對保留時間RSD值小于0.94%，相對峰面積RSD小于3.1%，實驗結果表明儀器精密度良好。

2.7 供試品的檢測

取5個產(chǎn)地13批茯苓藥材，按既定方法制備供試藥液，分別取已制備好的各供試樣品20μL，注入高效液相色譜儀分析，記錄60min內(nèi)的色譜圖，記錄所有峰相對保留時間和相對峰面積。

3 指紋圖譜及各項技術參數(shù)

茯苓藥材指紋圖譜見圖1，分析比對5個不同產(chǎn)地的茯苓藥材供試品HPLC指紋圖譜（圖2），確定其中8個峰為共有峰，詳見表3。采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版），對5個產(chǎn)地13批茯苓藥材指紋圖譜進行分析，各圖譜相似度介于0.893～0.963之間，詳見表4。其中10份藥材指紋圖譜相似性在0.96以上，僅有霍山縣所產(chǎn)茯苓藥材的相似性略低，為0.90左右，說明岳西及其周邊縣市所產(chǎn)茯苓所含成分種類及含量具有一致性，差異較小。

圖1 茯苓藥材及加入茯苓酸標準品色譜圖

其中峰4經(jīng)與標準品比對為茯苓酸，設定其為基礎峰，各檢測圖譜以基礎峰的保留時間、峰面積為參照，計算圖譜中各特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD，結果顯示：5批茯苓藥材相對保留時間RSD＜0.98%，相對峰面積RSD小于4.79%，說明5批茯苓藥材所含成分及含量均較相似，詳見表5。

圖2 13批茯苓藥材指紋圖譜

表3 岳西及周邊地區(qū)茯苓藥材共有特征峰

表4 岳西及周邊地區(qū)圖譜相似度分析結果

表5 茯苓指紋圖譜測定結果（RT－保留時間，Area－峰面積）

4 討 論

（1）安徽大別山一帶自古以來就是茯苓藥材的重要產(chǎn)區(qū)，特別是岳西縣所產(chǎn)茯苓遠近聞名，并且在藥材性狀上具有獨特之處。通過與其他產(chǎn)區(qū)茯苓藥材的比對，發(fā)現(xiàn)安徽茯苓的化學成分與其他產(chǎn)地存在差異［4］。本實驗采用高效液相色譜法，建立了岳西及周邊縣區(qū)茯苓藥材指紋圖譜。通過分析比對，安徽岳西及周邊一帶所產(chǎn)茯苓藥材樣本整體相似度較高，保留時間和峰面積均較為相似，提示該區(qū)域藥材質(zhì)量相近、穩(wěn)定一致，具有良好的相關性。這可能是由于大別山一帶地理位置、氣候、土壤等因素均較為相似，所產(chǎn)茯苓藥材的化學成分種類及含量較為相似和一致。

（2）本實驗所建立的指紋圖譜分析方法簡單易行、穩(wěn)定可靠，具有良好的系統(tǒng)性、特征性和重現(xiàn)性，特征峰數(shù)目較多，且峰型較好，所用材料易于處理，可作為岳西大別山一帶茯苓藥材與其他產(chǎn)區(qū)鑒別及質(zhì)量控制的參考方法。

（3）岳西茯苓的色譜圖顯示保留時間54min左右存在一個色譜峰，而其他產(chǎn)地茯苓藥材在此峰位沒有明顯峰型。這提示岳西茯苓在小極性區(qū)域存在一個獨特成分，相比其他產(chǎn)區(qū)茯苓含量明顯較高。結合岳西茯苓具有特有的香氣，猜測該成分或為一種揮發(fā)油或萜類，詳情有待進一步研究。

［1］凌一揆，顏正華.中藥學［M］.3版.上海：上海科學技術出版社，1984：95

［2］張思訪，劉靜涵，蔣建勤，等.茯苓的化學成分和藥理作用及開發(fā)［J］.中華實用中西醫(yī)結合雜志，2005，18（2）：227－230

［3］段啟，李霞蘭，王少軍，等.HPLC法測定茯苓皮中茯苓酸［J］.中草藥，2006，37（2）：284－285

［4］許臘英，萬芳，付文強，等.不同產(chǎn)地茯苓中萜類成分的HPLC指紋圖譜研究［J］.湖北中醫(yī)學院學報，2007，9（3）：41－43

［5］蘆錳，賀?；ǎ瑮钤?，等.反相高效液相色譜法對茯苓飲片指紋圖譜的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（10）：2531－2533