張欣悅,孫成春,公衍文,楊傳偉,劉 穎
(1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生院,遼寧錦州121001;2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科,山東濟(jì)南 250031;3.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實驗診斷科,山東 濟(jì)南 250031;4.山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司研發(fā)部,山東 濟(jì)南 250104;5.天津藥物研究院,天津 300100)
鮑曼不動桿菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌,主要引起呼吸道感染、敗血癥、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎等。近年來研究表明,鮑曼不動桿菌在醫(yī)院感染中占第4位,已成為醫(yī)院感染的重要病原菌,并有逐年升高的趨勢[1]。由于碳青霉烯類藥物治療鮑曼不動桿菌感染的療效較好,在醫(yī)院感染的治療中被廣泛使用,使得耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii,CRAB)越來越多,給臨床治療帶來很大困難,已引起臨床和微生物學(xué)者的嚴(yán)重關(guān)注[2]。
Drlica等[3]提出的防突變濃度(mutant prevention concentration,MPC)和突變選擇窗(mutant selection window,MSW)理論,為有效抑制細(xì)菌耐藥及制定應(yīng)對策略提供了新的思路和參考依據(jù)。該理論是指最低抑菌濃度(MIC)到 MPC之間的范圍。MPC是防止耐藥突變菌株被選擇性富集擴(kuò)增所需的最低抗菌濃度,也是評價抗菌藥物防耐藥能力的新指標(biāo)?;谠摾碚?,當(dāng)兩種或以上藥物聯(lián)合應(yīng)用時,細(xì)菌需要同時突變兩次或多次才能產(chǎn)生突變菌株,但這種概率非常低,從而使MSW縮小或關(guān)閉。目前關(guān)于MFX聯(lián)合CFS對CRAB的MPC的影響研究尚未見報道。本研究通過體外MFX聯(lián)合CFS對CRAB的MPC影響,探討抗菌藥物聯(lián)用降低MPC、縮小MSW的規(guī)律,為臨床合理使用有限的抗菌藥物、防止突變菌株的出現(xiàn)提供理論依據(jù)。
1.1 抗菌藥物與培養(yǎng)基 莫西沙星(0.4 g/片,拜耳醫(yī)藥保健有限公司);頭孢哌酮(cefoperazone,批號:30420-200304,含量:96.5%)、舒巴坦(sulbactam,批號:30430-200305,含量:89.2%)均購自中國藥品生物制品檢定所。M-H肉湯粉和M-H瓊脂平板培養(yǎng)基均購自英國Oxiod公司。
1.2 菌株來源與鑒定 選擇我院2010年1月~2012年8月臨床標(biāo)本中分離的20株CRAB。質(zhì)控菌為銅綠假單胞菌ATCC27853。經(jīng)VITEK-2分析儀鑒定,采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer法)進(jìn)行藥敏試驗,選取對亞胺培南或美羅培南耐藥的鮑曼不動桿菌20株。
1.3 實驗儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱(山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司);Vitek比濁儀、VITEK-2全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司);XK 96-3型微量振蕩器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);-80℃超低溫冰箱(SANYO Electric Co.Ltd.)。
1.4 最低抑菌濃度的測定
1.4.1 測定單獨應(yīng)用時的MIC 采用微量肉湯稀釋法測定MFX和CFS分別使用時的MIC,并按美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)2012年標(biāo)準(zhǔn)[4]判斷結(jié)果。
1.4.2 測定MFX和CFS聯(lián)合應(yīng)用時的MIC 采用簡化棋盤法[5]測定MFX和CFS聯(lián)用時的MIC。
1.4.3 計算部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration,F(xiàn)IC)指數(shù)及判定標(biāo)準(zhǔn) FIC指數(shù) =MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用。判定標(biāo)準(zhǔn):FIC指數(shù)≤0.5,協(xié)同作用;0.5~1,相加作用;1~2,無關(guān)作用;FIC>2,拮抗作用。
1.5 防耐藥突變濃度(MPC)的測定[6-7]
1.5.1 含單藥瓊脂平板的配制 采用瓊脂平板倍比稀釋法測定抗菌藥物對20株CRAB的 MPC。MFX和CFS的藥物濃度范圍分別為0.125~512 mg·L-1和2~512 mg·L-1。每個濃度配制4個平板作為平行對照。
1.5.2 含兩藥瓊脂平板的配制 以MFX和CFS的MIC、MPC為基準(zhǔn),采用二倍稀釋法配制含MFX與CFS混合的系列不同濃度梯度瓊脂平板。最低濃度為MFX和CFS的單藥MIC,最高濃度為MFX和CFS的單藥MPC,每個濃度4個平板。
1.5.3 菌懸液制備 從新鮮過夜培養(yǎng)的細(xì)菌平板上挑取單個菌落接種于20 ml MH肉湯中37℃震蕩過夜培養(yǎng),3 000 r·min-1離心后棄上清,再懸浮在200 ml MH肉湯中,震蕩培養(yǎng)6 h,3 000 r·min-1離心,棄上清,調(diào)整菌液濃度為3×1013CFU·L-1。
1.5.4 MPC的測定 取100μl 3×1013CFU·L-1菌液均勻涂布于含不同濃度藥物的MH平板上,每個濃度4個平板。(35±2)℃培養(yǎng)72 h,以4個平板均無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MPC。對含單藥瓊脂平板的測定為單藥MPC,對含兩藥瓊脂平板的測定即為聯(lián)合用藥后的MPC。對接近MPC藥物濃度篩選出來的菌株接種于無藥物的MH平皿,傳代兩次后,再接種于原篩選藥物濃度的平板上,以確定其是耐藥突變株。以上實驗重復(fù)兩次,取其平均值。
1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對秩和檢驗分析。
Tab 1 Accumulative inhibitory rate of MIC(mg·L-1)for 2 antimicrobial agents against 20 strains of CRAB
2.1 抗菌藥物對20株CRAB的MIC值 MFX和CFS對20株CRAB的MIC范圍分別為:0.125~2 mg·L-1、8~32 mg·L-1,見 Tab 1。
2.2 聯(lián)合藥敏 MFX與CFS聯(lián)用后,協(xié)同作用所占的比例為0.45(9/20),相加所占的比例為0.35(7/20),無關(guān)作用所占的比例為 0.20(4/20),未見拮抗作用,以協(xié)同和相加作用為主。
2.3 抗菌藥物單用及聯(lián)合使用對CRAB的MPC和SI值 MFX、CFS單用對20株CRAB的MPC范圍分別為4~64 mg·L-1、128~256 mg·L-1;MFX、CFS聯(lián)合使用后,兩者對20株CRAB的MPC范圍分別為:0.5~4 mg·L-1、64~128 mg·L-1。MFX、CFS單用對20株CRAB的選擇指數(shù)(selectiveity index,SI=MPC/MIC)分別為:4~128、8~64;MFX、CFS聯(lián)合使用后兩者對20株CRAB的SI分別為:1~8、4~16,見 Tab 2。
鮑曼不動桿菌是一種臨床常見和重要的醫(yī)院感染病原菌。近年來,隨著臨床治療中碳青霉烯類抗生素濫用現(xiàn)象的日益普遍,該菌對此類藥物的耐藥性明顯增強(qiáng)[8],已成為當(dāng)今醫(yī)院感染最為棘手的問題之一。
目前臨床應(yīng)用的MIC給藥策略,在抑制或殺滅敏感菌的同時,使耐藥突變菌得到富集擴(kuò)增,導(dǎo)致治療失敗。MSW理論[9]表明:當(dāng)藥物濃度高于 MPC時,病原菌必須突變兩次或更多次才能生存,而這種突變的概率非常低。豆梅琴等[10]通過測定氟喹諾酮類抗菌藥物的MPC,認(rèn)為當(dāng)其濃度高于MPC時,可有效防止鮑曼不動桿菌耐藥突變體的產(chǎn)生。這與本文MFX單用所測MPC相吻合。結(jié)合文獻(xiàn)[11]報道的MFX最大血藥濃度 Cmax(4.5 mg·L-1),本試驗表明:單用MFX,藥物濃度往往落在MSW內(nèi),易產(chǎn)生耐藥。若要增大MFX的給藥劑量,可能會給患者帶來更嚴(yán)重的風(fēng)險,可見單用MFX并不能產(chǎn)生理想療效。
MSW理論表明:當(dāng)兩種不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用,并同時處于各自的MIC以上時,細(xì)菌很難同時產(chǎn)生兩種耐藥突變,使其MSW關(guān)閉或縮小,從而達(dá)到防止耐藥菌產(chǎn)生及減少不良反應(yīng)的目的。Cai等[12]報道了多粘菌素聯(lián)合左氧氟沙星或妥布霉素可縮小其對多耐藥鮑曼不動桿菌的MSW,防止對多粘菌素耐藥的菌株出現(xiàn)。本研究的體外聯(lián)合藥敏結(jié)果顯示,MFX聯(lián)合CFS主要表現(xiàn)為協(xié)同和相加作用,無拮抗作用。因此兩藥聯(lián)用,可增強(qiáng)抑菌效果。結(jié)合藥代動力學(xué)參數(shù)分析,MFX單用時,其MPC大部分高于Cmax,聯(lián)合CFS后,MPC明顯降低到Cmax以下,有效的限制了耐藥菌株的產(chǎn)生;對于CFS,頭孢哌酮和舒巴坦的平均血清峰濃度分別為236.8 mg·L-1和130.2 mg·L-1。同 MFX一樣,聯(lián)合使用后,CFS的MPC降到Cmax以下。可見,將臨床常用的MFX和CFS聯(lián)合后,各自MPC明顯降低,使其藥物濃度高于MPC,進(jìn)而有效防止耐藥菌株的產(chǎn)生;該實驗還表明,將MFX與CFS聯(lián)合使用,SI較其單用均有明顯下降。再次證實了聯(lián)用不同作用機(jī)制的抗菌藥物可減少耐藥菌的產(chǎn)生,獲得良好的療效。
本研究對MFX聯(lián)合CFS在治療CRAB感染方面進(jìn)行了初步探討,為臨床合理使用現(xiàn)有抗菌藥物、防止耐藥菌產(chǎn)生提供了一定的理論指導(dǎo)和支持。由于體內(nèi)藥物濃度不斷變化,影響因素復(fù)雜,聯(lián)合用藥時的藥代動力學(xué)相關(guān)參數(shù)與耐藥突變體富集的關(guān)系仍需進(jìn)行相關(guān)的體內(nèi)研究。
(致謝:本文在統(tǒng)計方面得到了濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院于莉莉博士的指導(dǎo)和幫助,在此一并感謝?。?/p>
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