許沈南?李佳杰?盧旭生?張偉亮

【摘要】 目的 探索人巨細(xì)胞病毒感染與膽總管囊腫的相關(guān)性。方法 使用人巨細(xì)胞病毒熒光定量PCR分別對(duì)25例膽總管囊腫和20例對(duì)照組患者肝臟組織進(jìn)行檢測(cè)， 同時(shí)進(jìn)行病理染色和人巨細(xì)胞病毒晚期蛋白免疫組化檢測(cè)。結(jié)果 對(duì)照組均為檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果， 實(shí)驗(yàn)組中， 人巨細(xì)胞病毒陽(yáng)性14例（陽(yáng)性率56%）。免疫組化結(jié)果顯示陽(yáng)性蛋白多位于肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞當(dāng)中， 膽管上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)論 膽總管囊腫與人巨細(xì)胞病毒感染之間存在密切相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 巨細(xì)胞病毒感染；膽總管囊腫

先天性膽總管囊腫（congenital choledochal cyst， CCC）是一種伴有膽汁淤積的外科膽道疾病， 是膽道系統(tǒng)常見(jiàn)先天畸形[1]。小兒膽總管囊腫穿孔在小兒時(shí)期很少見(jiàn)， 一旦出現(xiàn)則病情重， 早期診斷較困難， 其發(fā)病機(jī)理至今尚不清楚。在臨床診治中發(fā)現(xiàn)巨細(xì)胞病毒（cytomegalo virus）與穿孔有一定的關(guān)聯(lián)[2]， 相關(guān)實(shí)驗(yàn)也提示該病與人巨細(xì)胞病毒感染之間存在相關(guān)性。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)膽總管囊腫患者及對(duì)照組患者肝臟組織中的人巨細(xì)胞病毒進(jìn)行檢測(cè)， 為檢驗(yàn)和論證膽總管囊腫與人巨細(xì)胞病毒感染之間的相關(guān)性問(wèn)題提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 新鮮肝臟組織標(biāo)本源自普寧市人民醫(yī)院2010年～2013年施行手術(shù)的25例膽總管囊腫患者， 其中男13例， 女12例。全部病例手術(shù)時(shí)年齡在2～8歲， 平均（4±2）歲。同時(shí)收集對(duì)照組病例20例， 均來(lái)自于本院意外死亡尸檢小兒。

1. 2 方法 全部行B超及CT檢測(cè)， 診斷為膽總管囊腫， 手術(shù)中進(jìn)一步探查， 證實(shí)為膽總管囊腫。術(shù)中切取直徑約1 cm的肝右葉邊緣組織， 分成兩份， 一份用甲醛固定， 另一份于-80℃超低溫冰箱中保存。

2 主要試劑及設(shè)備

DNA提取試采用 QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit， 人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒， HCMV 晚期蛋白PP65單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) USCNLIFE 公司， 為兔抗人單克隆抗體， 其余免疫組化試劑均購(gòu)自DAKO公司。

3 熒光定量PCR

取約40 mg的肝臟標(biāo)本提取DNA， 提取過(guò)程嚴(yán)格按照QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)條件及結(jié)果判定均按照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行， 反應(yīng)結(jié)束后使用7300 system SDS software進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。具有反應(yīng)條件， 詳見(jiàn)表1。

表1 5種病毒FQ-PCR反應(yīng)條件

病毒名稱 第一步 第二步 第三步 第四步

HCMV 93℃ 2 min 93℃ 45 s，55℃ 60 s，10個(gè)循環(huán) 93℃ 30 s 55℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)

4 病理及免疫組織化學(xué)染色

肝臟組織使用甲醛固定后， 包埋成石蠟塊并進(jìn)行切片。病理染色方法包括HE 染色和MASSON染色。于此同時(shí)， 采用二步法對(duì)人巨細(xì)胞病毒晚期蛋白PP65進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色， 以包漿內(nèi)有明顯棕黃色為陽(yáng)性。

5 結(jié)果

5. 1 人巨細(xì)胞病毒在膽總管囊腫組織中的感染率 PCR結(jié)果顯示：25例膽總管囊腫患者肝臟組織中， HCMV陽(yáng)性者14例子， 陽(yáng)性率56%， 對(duì)照組20例HCMV均為陰性。

5. 2 膽總管囊腫組織病理變化 膽總管囊腫患者肝臟組織病理結(jié)果顯示：肝小葉有不同程度的變性壞死， 部分可見(jiàn)肝多核巨細(xì)胞， 匯管區(qū)膽栓形成， 膽小管增生， 膽道上皮細(xì)胞變性。以膽小管為中心， 炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)， 不同程度的纖維束包裹膽小管。詳見(jiàn)圖1。

5. 3 膽總管囊腫組織PP65分布情況 PCR檢測(cè)HCMV檢測(cè)陽(yáng)性者， PP65免疫組化染色可見(jiàn)：PP65 均位于感染細(xì)胞胞漿當(dāng)中， 陽(yáng)性細(xì)胞多較集中分布于肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和炎性浸潤(rùn)細(xì)胞， 膽道上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。詳見(jiàn)圖2。

6 討論

CMV是一種DNA病毒。HCMV是人體最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染病毒之一。用檢測(cè)方法調(diào)查HCMV感染率， 發(fā)達(dá)國(guó)家人群感染率40%～60%， 發(fā)展中國(guó)家95%～99%。近年來(lái)， 隨著研究的深入， 很多學(xué)者已認(rèn)識(shí)到膽總管囊腫不能簡(jiǎn)單歸于先天性疾病， 而更可能是圍生期的一種進(jìn)行性病變。其明顯的季節(jié)和地區(qū)聚集趨勢(shì)的特點(diǎn)提示該病可能與環(huán)境中某種感染因素的損傷有關(guān)[2]。隨后相關(guān)的研究也表明病毒感染與膽總管囊腫存在相關(guān)性[3]。

但具體是哪一種病毒卻值得探索， 近年來(lái)人們采用多種方法對(duì)膽總管囊腫和多種病毒感染之間的相關(guān)性問(wèn)題進(jìn)行研究， 相關(guān)研究也證實(shí)該病與多種病毒之間存在相關(guān)性， 其中主要病毒包括呼腸病毒、輪狀病毒和巨細(xì)胞病毒3大類[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)使用PCR方法直接檢測(cè)患者肝臟組織當(dāng)中HCMV的陽(yáng)性率， 并使用尸檢患兒肝臟組織作為對(duì)照組， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膽總管囊腫患者的陽(yáng)性率高達(dá)56%， 而對(duì)照組則未有陽(yáng)性病例。此數(shù)據(jù)與國(guó)內(nèi)董永綏等[7]進(jìn)行大規(guī)模前瞻性研究得出的普通嬰幼兒CMV肝炎發(fā)生率（42%）相比， 提示BA病因?yàn)镠CMV感染的可能。進(jìn)一步提示了膽總管囊腫與巨細(xì)胞病毒的相關(guān)性。

于此同時(shí)， 作者注意到膽總管囊腫患者的膽道上皮細(xì)胞上HCMV晚期蛋白PP65的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性， 且膽道上皮細(xì)胞亦出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。提示HCMV對(duì)膽總管囊腫患兒的膽道上皮細(xì)胞具有侵襲性， 可誘發(fā)膽道上皮細(xì)胞的凋亡， 從而影響膽小管的功能與結(jié)構(gòu)。

將通過(guò)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)本次研究的檢測(cè)結(jié)果， 將HCMV打入到胎鼠當(dāng)中， 觀察其膽道的變化。HCMV與膽總管囊腫之間存在相關(guān)性， 可謂臨床上膽總管囊腫的防治提供科研依據(jù)， 造?；純?。

參考文獻(xiàn)

[1] Alford CA， Stagno S， Pass RF， Britt WJ.Congenital and Perinatal cytomegalovirus infections.Res Infect Dis ， 1990， 125Suppl7：S745-753.

[2] Wu T C， Hruban R H， Ambinder R F， et al. Demonstration of cytomegalovirus nucleic acids in the coronary arteries of transplanted hearts. The American journal of pathology， 1992， 140（3）： 739.

[3] 馮杰雄.病毒感染與膽總管囊腫的關(guān)系.實(shí)用兒科臨床雜志， 2007， 22（ 23）：1761-1763.

[4] Szavay PO， Leonhardt J， Czech-Schmidt G， et al. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. Eur J Pediatr Surg， 2002， 12（4）：48-50.

[5] Bobo L， Ojeh C， Chiu D， et al. Lack of evidence for rotavirus by polymerase chain reaction/enzyme immunoassay of hepatobiliary samples from children with biliary atresia. Pediatr Res， 1997， 41（2）：229-234；

[6] De Tommaso AM， Andrade PD， Costa SC， et al. High frequency of human cytomegalovirus DNA in the liver of infants with extra-hepatic neonatal cholestasis. BMC Infect Dis， 2005， 12（1）：108；

[7] 董永綏， 方峰， 魏晶， 等.巨細(xì)胞病毒感染的母嬰傳播研究.中國(guó)實(shí)用兒科雜志， 2000， 15（3）： 334-335.

參考文獻(xiàn)

[1] Alford CA， Stagno S， Pass RF， Britt WJ.Congenital and Perinatal cytomegalovirus infections.Res Infect Dis ， 1990， 125Suppl7：S745-753.

[2] Wu T C， Hruban R H， Ambinder R F， et al. Demonstration of cytomegalovirus nucleic acids in the coronary arteries of transplanted hearts. The American journal of pathology， 1992， 140（3）： 739.

[3] 馮杰雄.病毒感染與膽總管囊腫的關(guān)系.實(shí)用兒科臨床雜志， 2007， 22（ 23）：1761-1763.

[4] Szavay PO， Leonhardt J， Czech-Schmidt G， et al. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. Eur J Pediatr Surg， 2002， 12（4）：48-50.

[5] Bobo L， Ojeh C， Chiu D， et al. Lack of evidence for rotavirus by polymerase chain reaction/enzyme immunoassay of hepatobiliary samples from children with biliary atresia. Pediatr Res， 1997， 41（2）：229-234；

[6] De Tommaso AM， Andrade PD， Costa SC， et al. High frequency of human cytomegalovirus DNA in the liver of infants with extra-hepatic neonatal cholestasis. BMC Infect Dis， 2005， 12（1）：108；

[7] 董永綏， 方峰， 魏晶， 等.巨細(xì)胞病毒感染的母嬰傳播研究.中國(guó)實(shí)用兒科雜志， 2000， 15（3）： 334-335.

參考文獻(xiàn)

[1] Alford CA， Stagno S， Pass RF， Britt WJ.Congenital and Perinatal cytomegalovirus infections.Res Infect Dis ， 1990， 125Suppl7：S745-753.

[2] Wu T C， Hruban R H， Ambinder R F， et al. Demonstration of cytomegalovirus nucleic acids in the coronary arteries of transplanted hearts. The American journal of pathology， 1992， 140（3）： 739.

[3] 馮杰雄.病毒感染與膽總管囊腫的關(guān)系.實(shí)用兒科臨床雜志， 2007， 22（ 23）：1761-1763.

[4] Szavay PO， Leonhardt J， Czech-Schmidt G， et al. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. Eur J Pediatr Surg， 2002， 12（4）：48-50.

[5] Bobo L， Ojeh C， Chiu D， et al. Lack of evidence for rotavirus by polymerase chain reaction/enzyme immunoassay of hepatobiliary samples from children with biliary atresia. Pediatr Res， 1997， 41（2）：229-234；

[6] De Tommaso AM， Andrade PD， Costa SC， et al. High frequency of human cytomegalovirus DNA in the liver of infants with extra-hepatic neonatal cholestasis. BMC Infect Dis， 2005， 12（1）：108；

[7] 董永綏， 方峰， 魏晶， 等.巨細(xì)胞病毒感染的母嬰傳播研究.中國(guó)實(shí)用兒科雜志， 2000， 15（3）： 334-335.