楊相政 李喜宏 馬宏原 申靈敏

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

飼料在生產、加工、運輸儲藏過程中會因為各種自然環(huán)境因素使飼料的原有養(yǎng)分降低和品質的劣化，嚴重者導致畜禽采食后中毒或死亡［1－2］。飼養(yǎng)的動物食用了細菌總數(shù)超標的飼料，一旦免疫力降低，就會引發(fā)疾病，給養(yǎng)殖場帶來巨大經(jīng)濟損失。影響飼料品質最重要的因素是霉菌的破壞，據(jù)聯(lián)合國糧農組織估計，全世界每年大約有5%～7%的糧食、飼料等農產品遭受霉菌的侵蝕，全世界每年由此造成的經(jīng)濟損失可達數(shù)千億美元。我國每年因為在儲藏過程受到霉菌污染而變質浪費的飼料占總產量的15%左右［3］。因此，飼料霉菌毒素感染已成為飼料工業(yè)和畜牧業(yè)生產中不可忽視的問題。

飼料的腐敗變質主要是發(fā)生在儲藏期間，霉變飼料中的霉菌毒素不僅降低了飼料的營養(yǎng)價值，還會誘發(fā)畜禽的急慢性中毒，嚴重時還可造成畜禽中毒死亡，其中影響最強、毒性最大的黃曲霉毒素B1能引起動物急性中毒死亡，有強烈的致癌作用［4－5］，還會影響奶、蛋、肉等畜產品的質量，直接危害人的健康。因此研究如何防止飼料的的腐敗變質具有非常重要的現(xiàn)實意義。目前國內外對雞飼料加工、運輸、儲藏期間防止霉菌腐敗變質的研究主要集中在添加防腐劑、防腐包裝和射線照射結合化學處理等［5］，其中運用最多是添加防腐劑防腐。但是防霉劑不能完全保證飼料不霉變，只能在一定條件下延長飼料霉變的時間［6］，而且作用的范圍有限［7］。對于氣調儲藏飼料防霉變鮮有報道。

糧食氣調儲藏是國際上應用較為普遍和先進的糧食儲藏方法之一，可以比較好的保持糧食品質，殺滅害蟲，防止有害微生物的生長［8］。本試驗采用高CO2氣調儲藏技術儲藏雞飼料，通過測定分析雞飼料的細菌總數(shù)、霉菌總數(shù)和黃曲霉總數(shù)的變化，研究高CO2對雞飼料霉變的調控效應，以期為CO2氣調儲藏雞飼料的應用提供技術參考和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

雞飼料:天津市新星獸藥廠，主要成分為玉米60%、豆粕13%和麩皮9%，含水量11%。

1.2 主要儀器和試劑

DK－98－1型數(shù)顯恒溫水浴鍋:天津市泰斯特儀器有限公司;WH－3微型漩渦混合儀:上海滬西分析儀器有限公司;SHZ－82型恒溫振蕩器:常州國華電器有限公司;YXZ280B型高壓滅菌鍋:上海三申醫(yī)療器械有限公司;YS100型Nikon生物顯微鏡:上海澤仕光電科技有限公司;手持式O2/CO2分析儀:北京卓川電子科技有限公司;甲醇:天津市風船化學試劑科技有限公司;毒素檢測試劑盒:上海必發(fā)生化科技有限公司

1.3 處理方法

稱取每份1 kg雞飼料裝入布袋，再放入10 L氣調瓶中，充入不同濃度的CO2和O2的混合氣體。儲藏的氣體條件為:自然空氣(CK)、2%～3%O2+30%CO2(TR1)、2%～3%O2+50%CO2(TR2)。在實驗室低溫糧食保鮮庫內，調節(jié)TD－2型溫度梯度箱工作溫度分別為0、10、23和30℃，將各處理分別置于不同溫度的梯度箱內，儲藏時間4月，定期使用手持式O2/CO2分析儀定期檢測氣體變化，調整氣體環(huán)境。每30 d取樣測定1次指標。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 細菌總數(shù)

測定程序參照GB/T 13093—2006《飼料中細菌總數(shù)的測定》方法測定。所用培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基。

1.4.2 霉菌總數(shù)

測定程序參照GB/T 13092—2006《飼料中霉菌總數(shù)的測定》方法進行測定。所用培養(yǎng)基為高鹽察氏培養(yǎng)基。

1.4.3 黃曲霉總數(shù)

測定程序參照GB/T 4789.16—2003《常見產毒菌的鑒定》對菌落進行鑒定。

1.4.4 黃曲霉毒素B1含量的檢測

利用Bcacon毒素檢測試劑盒進行飼料中毒素含量的檢測。已提供的試劑與材料有:真空包裝且包含干燥劑的8 mm×12 mm的微孔板;5瓶質量濃度分別為 0、2.0、4.0、10、25 μg/kg 的霉菌毒素標準品;1瓶酶標記物;1瓶底物溶液;1瓶停止液。

1.4.4.1 提取液的制備

將80 mL甲醇和20 mL蒸餾水置于錐形瓶中，震蕩搖勻。

1.4.4.2 樣品制備

粉碎后的樣品過20目篩，稱取50 g樣品和5.0 g氯化鈉置于帶塞錐形瓶中，并向其中加入100 mL甲醇/水(80∶20)提取液，搖勻，靜置2～3 min使樣品沉淀，然后用玻璃纖維濾紙過濾10 mL萃取液，取5 mL萃取液用20 mL蒸餾水稀釋，過濾稀釋液待測。

1.4.4.3 檢測程序

先將毒素標準品溶液及樣品液加入測試孔中，然后向測試孔中加入毒素的酶標記物，樣品及酶標記物競爭結合連接在微孔上的抗體，10 min培養(yǎng)后，倒掉孔中的溶液，洗掉微孔中未結合的霉菌毒素和酶標記物，加入無色的底物溶液，培養(yǎng)10 min，所有結合的酶標記物使底物轉化成藍色物質。加入停止液，然后將測試孔放在酶標儀上讀取吸光度值，未知濃度樣品與標準吸光度值進行比較，就可以得到樣品的黃曲霉毒素B1的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

全部試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007進行統(tǒng)計處理，采用SPSS10.0軟件檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 細菌總數(shù)的檢測

當溫度一定時，在一定濃度范圍內，隨著二氧化碳濃度的升高，其抑菌效果越明顯。但是超出一定濃度界限時，隨著二氧化碳濃度升高，抑菌效果反而下降［8］。褚益可等［9］研究牛肉的氣調保鮮結果表明:不是CO2濃度越高其抑菌效果越強，當CO2體積分數(shù)達到45%后，其抑菌能力反而隨著CO2濃度的升高而下降。

不同的氣體環(huán)境對飼料中細菌總數(shù)的影響較大(表1)。在0℃時，高濃度CO2對雞飼料抑菌效果很明顯。雞飼料在30%CO2和50%CO2的條件下儲藏90 d細菌總數(shù)都小于限量標準2×106cfu/g，前60 d細菌增長相對較慢;10℃時，30%CO2和50%CO2的條件下儲藏60 d后，細菌總數(shù)不超標;30℃時，30%CO2和50%CO2的條件下儲藏30 d內，細菌總數(shù)不超標。當溫度一定時，CO2體積分數(shù)為0%～50%的范圍內，隨著二氧化碳濃度的升高，對細菌生長的抑制就越明顯(圖1)。

表1 細菌菌落總數(shù)均值

圖1 雞飼料不同濃度CO2處理同一稀釋濃度下儲藏60 d后細菌菌落圖

2.2 霉菌總數(shù)的檢測

氣體對真菌的代謝活動有明顯影響。高濃度二氧化碳氣體環(huán)境下，霉菌孢子很難萌發(fā)，繁殖較慢［9］。

如表2和圖2可知，當溫度一定，高濃度的CO2對霉菌的生長有明顯的抑制作用。0℃時，30%CO2下，霉菌生長極其緩慢，儲藏120 d后，霉菌總數(shù)遠小于對照組(CK)，低于國家限量標準4.5×103cfu/g;50%CO2時，霉菌幾乎不生長，總數(shù)基本不變。10℃時，CO2體積分數(shù)為30%和50%條件下，飼料儲藏120 d后，霉菌總數(shù)不超標，而對照組儲藏60 d后，霉菌總數(shù)超過限量標準，飼料已經(jīng)霉變。30℃時，高濃度的CO2對霉菌的抑制效果不是特別顯著，CO2體積分數(shù)為30%和50%時，飼料儲藏超過60 d霉菌均低于限量標準。對照組儲藏30 d后，霉菌已經(jīng)超標，飼料的營養(yǎng)成分已經(jīng)受到霉菌的破壞。

表2 霉菌菌落總數(shù)均值

圖2 雞飼料不同濃度CO2處理同一稀釋濃度下儲藏60 d后霉菌菌落圖

2.3 黃曲霉總數(shù)的檢測

當二氧化碳體積分數(shù)達到60%以上時，能抑制小麥或玉米內的霉菌生長及青霉或黃曲霉毒素的產生［10－11］。由表3和圖3可知，高濃度 CO2明顯抑制雞飼料內黃曲霉的生長，并且濃度越高，效果越明顯。當溫度為0℃和10℃時，50%CO2對黃曲霉生長抑制顯著，黃曲霉生長緩慢;當溫度為30℃時，抑菌效果不顯著，這與霉菌總數(shù)增長趨勢一致?？梢?，高濃度CO2對于常溫和低溫儲藏下的雞飼料內霉菌的生長抑制效果顯著，而對于高溫儲藏下的雞飼料內的霉菌生長抑制效果不顯著。

表3 黃曲霉菌菌落總數(shù)均值

圖3 飼料中黃曲霉菌落的不同形態(tài)

2.4 常溫儲存下黃曲霉毒素隨時間的變化情況

高濃度CO2處理可有效抑制雞飼料常溫儲藏過程中黃曲霉毒素B1含量的變化，而對照組黃曲霉毒素B1含量變化很大。由圖4可知，儲藏到90 d，30%CO2和50%CO2處理的雞飼料黃曲霉毒素B1的含量分別為 19.3 μg/kg 和 12.6 μg/kg，均低于國家限量標準20μg/kg。儲藏到120d，50%CO2處理的雞飼料黃曲霉毒素B1的含量為17.4 μg/kg，仍低于國家標準，而對照組黃曲霉毒素B1的含量為56.2 μg/kg，遠遠超出國家標準，而且飼料已經(jīng)發(fā)生嚴重霉變，顏色變黑，有惡臭，幾乎失去使用價值。因此高濃度的能有效抑制飼料中霉菌特別是黃曲霉的生長，進而抑制黃曲霉毒素的產生。

圖4 不同濃度CO2處理對黃曲霉毒素B1含量的影響

3 結論

3.1 當溫度一定時，在一定濃度范圍內，CO2濃度越高，對雞飼料內細菌和霉菌的抑制效果越顯。高濃度的CO2對于常溫和低溫儲藏下的雞飼料內霉菌的生長抑制效果顯著，而對于高溫儲藏下的雞飼料內的霉菌生長抑制效果不顯著。

3.2 高濃度CO2對于室溫下儲藏的雞飼料內黃曲霉的生長以及黃曲霉毒素B1含量的變化有明顯的影響，50%CO2處理能明顯抑制黃曲霉的生長和黃曲霉毒素B1的產生，進而防止飼料霉變變質。

3.3 10℃ +30%CO2和常溫+50%CO2的儲藏環(huán)境可有效抑制雞飼料內細菌和霉菌的生長，用于雞飼料防霉儲藏。雞飼料在此條件下儲藏90 d細菌總數(shù)、霉菌總數(shù)以及黃曲霉毒素均低于國家限量標準。

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