陳 珊，華 梅，劉 迪，趙書博，李 凡，劉東波，夏紅梅

(東北師范大學 生命科學學院，吉林 長春130024)

纖維素是由吡喃型D－葡萄糖以β－1，4－糖苷鍵連接而成的直鏈大分子，是自然界中最廣泛存在的一類碳水化合物，也是地球上最豐富的再生資源。利用生物技術對植物纖維素進行生物轉化以生成人類急需的能源和化工原料等，將對緩解人類社會環(huán)境污染、食物短缺和能源危機等具有重大意義［1］。微生物所產(chǎn)生的纖維素酶的降解作用是纖維素資源開發(fā)利用的有效途徑，這些纖維素酶主要包括:內切葡聚糖酶(endo－l，4－β－D－glucanase，EC3.2.l.4)、外切葡聚糖酶［纖維二糖水解酶(l，4－β－D－glucan cellobiohydrolase，EC3.2.l.9l)和纖維糊精酶(cellodextrinase，EC3.2.l.74)］及β－葡萄糖苷酶(β－glucosidase，EC3.2.1.21)［2］。

產(chǎn)纖維素酶的微生物廣泛分布于真菌、細菌、放線菌等菌屬中，之前的研究多集中在木霉屬和青霉屬等真菌方面，但研究結果顯示雖然這些真菌產(chǎn)生的纖維素酶種類較多，活力較高，但仍然不能滿足實際生產(chǎn)的需求，特別是真菌在降解纖維素時還具有培養(yǎng)周期長、易染菌、耐堿性差、難以實現(xiàn)大工業(yè)生產(chǎn)等不足。近年來，陸續(xù)出現(xiàn)了細菌降解纖維素的報道，產(chǎn)芽孢細菌因具有特化的芽孢，在耐酸堿、耐高溫等方面顯現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢［3］，更利于實際操作和工業(yè)生產(chǎn)，因此成為目前纖維素降解微生物研究的重要方向。

本文從長白山森林土壤中篩選到了一株產(chǎn)纖維素酶的地衣芽孢桿菌，對其進行了分類鑒定，并研究了菌株產(chǎn)纖維素酶的最佳條件，為該菌的進一步應用及對纖維素的有效轉化提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基

1.1.1 富集培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)，1%;Mandels 無機營養(yǎng)鹽液［4］;蛋白胨，1%;瓊脂粉，1.5%;自然pH。

1.1.2 篩選培養(yǎng)基

CMC－Na，1%;Mandels 無機營養(yǎng)鹽液;瓊脂粉，1.5%;自然pH。

1.1.3 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基

CMC－Na，1%;NaCl，0.5%;KH2PO4，0.1%;MgSO4，0.02%;蛋白胨，1%;pH 7.2。

1.2 菌株的分離篩選

采集長白山森林土壤，置于無菌水中振蕩，打散后取上層水樣接入富集培養(yǎng)基中，連續(xù)富集培養(yǎng)3 次后，將上清液梯度稀釋涂布或劃線于篩選培養(yǎng)基平板上30℃培養(yǎng)至菌落長出，經(jīng)剛果紅染色、NaCl 脫色后，觀察菌落周圍是否有透明圈生成，并測定透明圈直徑與菌落直徑的比值，選取比值較大的菌株接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，測定發(fā)酵液的酶活性。

1.3 CMC 酶活力的測定

取1.5 mL 0.05mol/ L 緩沖液配制的1.0% CMC 溶液，加入0.5mL 適當稀釋的酶液，50℃反應30min 后用DNS 法測定酶解產(chǎn)生的還原糖量，酶活單位采用國際單位(International Unit，IU)，即在實驗條件下1 mL 酶液1 min 產(chǎn)生1?mol 還原糖的酶量作為1 個酶活單位U［5］。

1.4 菌株的鑒定

形態(tài)學鑒定參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［6］進行。分子生物學鑒定及進化分析依據(jù)該菌株的16S rDNA 序列，具體方法為首先提取菌株的基因組DNA［7］，以該基因組為模板擴增菌株的16S rDNA。所用PCR 引物為細菌鑒定通用引物:27F 5＇－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3＇，1492R 5＇－ACGGCTACCTTGTTACGACT－3＇。PCR 反應程序:94℃4 min;94℃1min，55 ℃30 s，72℃2min，30 個循環(huán);72℃10min。PCR產(chǎn)物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶回收后與PMD－18T 載體連接送長春庫美測序公司測序，測序結果在NCBI 進行BLAST 分析，以ClustalX 進行多序列比對后，采用MEGA4.0 的Neighbor－Joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

將2ml 種子液接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別置于25℃、30℃、37℃、40℃和45℃搖床中振蕩培養(yǎng)，間隔12h取樣。將發(fā)酵液樣品在8000rpm 條件下離心10min，所得上清液即為粗酶液。測定不同粗酶液樣品的CMC 降解活性，選取不同溫度下達到產(chǎn)酶高峰時的酶活性做比較，以最高活性為100%，其余活性換算為相對活性作圖，研究不同發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響。

1.6 培養(yǎng)基初始pH 對菌株產(chǎn)酶的影響

配制初始pH 分別為5、6、7、8、9 的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，接種后在測得的最適培養(yǎng)溫度下振蕩培養(yǎng)，間隔12h取樣。將發(fā)酵液樣品在8000rpm 條件下離心10min，測定上清液的CMC 降解活性，選取不同初始pH 培養(yǎng)基中達到產(chǎn)酶高峰時的酶活性做比較，以最高活性為100%，其余活性換算為相對活性作圖，研究培養(yǎng)基不同初始pH 對菌株產(chǎn)酶的影響。

1.7 碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

改變產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源種類，濃度均采用1%，接入2ml 種子液后置于最適培養(yǎng)溫度下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，達到產(chǎn)酶高峰后測定不同碳源條件下粗酶液的CMC 降解活性，研究不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響。

1.8 氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

分別選取典型的有機氮和無機氮作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的氮源，濃度均采用1%，接入2ml 種子液后置于最適培養(yǎng)溫度下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，達到產(chǎn)酶高峰后測定不同氮源條件下粗酶液的CMC 降解活性，研究不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響。

2 結果與討論

2.1 菌種的篩選

以CMC－Na 為唯一碳源進行菌種篩選，待細菌在平板上生長后，用0.1%的剛果紅水溶浸染15min，再用1M 的NaCl 水溶液脫色。剛果紅可將CMC－Na 染成紅色，而纖維素降解菌株周圍由于分泌的纖維素酶使CMC 降解為小分子糖不著色，因此可以明顯的觀察到透明圈的存在(圖1)。應用本方法成功的從長白山森林土壤中篩選到了多株對CMC 具有降解活性的菌株，選擇其中的芽孢桿菌DS1309 做為進一步的研究對象。

圖1 剛果紅染色后菌株周圍形成的透明圈

2.2 菌種的鑒定

菌株DS1309 在CMC 培養(yǎng)基及普通細菌培養(yǎng)基上生長菌落呈污白色，干燥，粗糙，不透明，中間凸起。菌體在顯微鏡油鏡下觀察呈桿狀，產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色為陽性，顯微形態(tài)圖見圖2。

在形態(tài)學觀察的同時對菌株進行了分子生物學鑒定。菌株16S rDNA 序列分析結果表明，該菌株的16S rDNA 序列與地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)16S rDNA 序列的同源性高達99%，將相關序列通過ClustalX 進行多序列比對后，利用MEGA4.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示在系統(tǒng)發(fā)育上菌株DS1309與地衣芽孢桿菌屬于同一分支。根據(jù)形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定結果，確定該菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。

2.3 地衣芽孢桿菌DS1309 產(chǎn)酶條件的研究

2.3.1 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

將2ml 種子發(fā)酵液接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，置于不同溫度下振蕩培養(yǎng)，間隔12h 取樣測定上清液的酶活性。結果顯示在30℃左右菌體生長旺盛，發(fā)酵液酶活力最高(圖3)，因此確定菌株DS1309 產(chǎn)纖維素酶的最適發(fā)酵溫度為30℃。

圖2 菌株DS1309 的顯微形態(tài)圖

圖3 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH 對菌株產(chǎn)酶的影響

制備產(chǎn)酶培養(yǎng)基分裝至三角瓶中，分別調節(jié)培養(yǎng)基的pH 為5、6、7、8 和9，接入2ml 種子液后，置于最適溫度30℃下培養(yǎng)，間隔12h 取樣測定上清液的酶活性，選取達到產(chǎn)酶高峰時的酶活性作圖。由圖4可知，初始發(fā)酵pH 對菌株產(chǎn)酶的影響比較明顯，在pH6.0 范圍內，隨著初始pH 的升高，CMC 降解酶活力增強，pH 為6.0 時菌株所產(chǎn)酶活力最高;pH 進一步升高后，發(fā)酵液酶活力迅速降低，在pH7.0 時酶活力僅為pH6.0 培養(yǎng)基中活力的40%，說明菌株DS1309 產(chǎn)纖維素酶的最適發(fā)酵初始pH 為6.0。

圖4 培養(yǎng)基初始pH 對菌株產(chǎn)酶的影響

2.3.3 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

分別選取CMC－Na、葡萄糖、蔗糖、麩皮和玉米秸稈作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源，研究不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響。結果(圖5)表明菌株DS1309 對碳源利用廣泛，除了能夠以CMC－Na 為碳源外，還能夠利用單糖、雙糖及麩皮、玉米秸稈等天然纖維素。碳源對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響順序為葡萄糖＞蔗糖＞麩皮＞玉米秸稈＞CMC－Na，最佳利用碳源為葡萄糖。同時研究也顯示出，以葡萄糖和蔗糖為碳源時，產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)較晚，推測當培養(yǎng)基中單糖和雙糖濃度較高時，有利于菌株的生長，但是對菌株產(chǎn)酶有產(chǎn)物抑制作用;隨著碳源的利用，糖濃度降低，抑制作用解除，纖維素酶產(chǎn)量迅速提高。

2.3.4 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

分別選取有機氮蛋白胨、酵母粉，無機氮NH4NO3、(NH4)2SO4 以及提供無極氮形式的有機物尿素作為氮源，研究不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響。結果(圖6)表明有機氮作為氮源的條件下，菌株發(fā)酵液的酶活力較高，最佳的氮源為酵母粉。同時結果還表明菌株能夠利用硝酸鹽生長并產(chǎn)酶，但對于銨鹽形式的無機氮源利用較差。

圖5 碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

圖6 氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

3 結 語

本文采用唯一碳源法從長白山森林土壤中篩選到了一株具有纖維素降解酶活力的芽孢桿菌DS1309，根據(jù)菌株的形態(tài)學觀察結果和16SrDNA 的系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定該菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。采用液體振蕩培養(yǎng)的方法，優(yōu)化了菌株DS1309 產(chǎn)CMCase 的發(fā)酵條件，結果顯示，菌株產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)溫度是30℃，培養(yǎng)基最適初始pH 為6.0，產(chǎn)酶的最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母粉，在最優(yōu)條件下發(fā)酵48h 后酶活可達到1.82 IU/mL。

［1］SunY，ChengJ.Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol Production:a review［J］.Bioresour Technol，2002，83:1－11.

［2］王鳳超.未培養(yǎng)微生物來源的纖維素酶功能基因的篩選［M］.濟南:山東大學碩士學位論文，2008.

［3］Trivedi N，Guota V，Kumar M，et al.An Alkali－h(huán)alotolerant Cellulase from Bacillus flexus Isolated from Green Seaweed Ulva lactuca［J］.Carblhydrate polymers，2011，83:891－897.

［4］高培基，曲音波，王祖農(nóng).纖維素酶解過程的分析和測定［J］.生物工程學報，1988，4(4):321－325.

［5］姚強，黃琰，陳冠軍.產(chǎn)耐堿性纖維素酶絲狀真菌的篩選及鑒定［J］.山東大學學報，2005，40(1):119－124.

［6］東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京:科學出版社，2001.

［7］F.M.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，等.精編分子生物學實驗指南［M］.北京:科學出版社，2008.