宮世玲，王 嘉，毛婭卿，吳 濤，王 哲，蔣桃珍

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）是由雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一種的急性、高度接觸性傳染病，主要危害3～6周齡雛雞。IBDV基因組由 A（3.2 kb）、B（2.8 kb）兩個雙鏈 RNA 節(jié)段構(gòu)成，A片段包含兩個部分重疊的開放閱讀框（ORF），大ORF編碼多聚蛋白 VP2－VP4－VP3，小 ORF編碼VP5蛋白，是一種非結(jié)構(gòu)蛋白；B片段編碼VP1蛋白，是一種具有RNA聚合酶活性的多功能蛋白。其中VP2被證明與毒力密切相關(guān)［1］，但也有研究表明VP2蛋白并非毒力決定的唯一因素，其他蛋白對病毒毒力和致病性也有影響［2－3］。盡管國內(nèi)外學(xué)者對IBDV的毒力基因進行了廣泛的研究，但其毒力因子至今仍未被確定。

對于IBDV來說，其毒力的判定標(biāo)準(zhǔn)主要有三個：死亡率、法氏囊的病理損傷值及囊體比的下降。其中死亡率主要是針對超強毒株，非超強毒株通常不引起雞的死亡，故法氏囊的病理損傷值及囊體比的下降被廣泛用于IBDV毒力的判定。而囊體比的下降較為簡單直觀，已被大多數(shù)研究所采用。將IBDV弱毒株在SPF雞體內(nèi)連續(xù)傳代，發(fā)現(xiàn)弱毒株在雞體內(nèi)傳代后囊體比大幅度下降，表明IBDV弱毒株在SPF雞體內(nèi)連續(xù)傳代后毒力返強。為進一步研究弱毒株及其雞體傳代毒毒力變化與基因的關(guān)系，本試驗測定了基礎(chǔ)弱毒株及其雞體傳代毒的基因組編碼區(qū)序列，并對其進行比較分析，以期從分子水平上為該病毒毒力相關(guān)位點的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和載體 IBDV弱毒株A、弱毒株B由本實驗室保存；大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞、pGEM－T載體均購于promega公司。21日齡SPF雞購于北京梅里亞動保公司。

1.2 主要試劑 TRIzol、Reverse Transcription System為invitrogen公司產(chǎn)品；pfu高保真聚合酶為promega公司產(chǎn)品；DNA Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 病毒在雞體內(nèi)傳代 將IBDV弱毒株A和B分別在雞體內(nèi)連續(xù)傳代，其中弱毒株B在雞體內(nèi)傳代兩次，每次傳代后，觀察法氏囊病變，計算囊體比（Bursa／Body Weight Ratio）和 B ∶B 指數(shù)（BBIX）。每代的法氏囊經(jīng)研磨處理后繼續(xù)傳代，一部分法氏囊樣品放在－80℃，用于病毒RNA的提取。

1.4 病毒基因組RNA的提取 采用TRIzol法提取基礎(chǔ)弱毒株及雞體內(nèi)傳代的各個代次囊毒的基因組RNA。

1.5 引物的設(shè)計與合成 參考GenBank中已發(fā)表的IBDV弱毒株序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計合成了4對引物（表1），用于基礎(chǔ)弱毒株及其雞體傳代毒的基因組編碼區(qū)序列的擴增。其中A片段分2部分進行擴增，分別為75～1687 bp，1506～3232 bp；基因組B片段分2部分進行擴增，分別為17～1521 bp，1365～2799 bp。

表1 引物序列及其位置

1.6 反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）用六聚體隨機引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，并以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，分別以 A1／A2、A3／A4、B1／B2、B3／B4 為引物進行PCR擴增。采用50 μL反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，上下游引物（10 μmol）各 2 μL，模板 5 μL，pfu 0.5 μL，ddH2O 31.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35個循環(huán)；72 ℃10 min。 取 5 μL PCR 產(chǎn)物，用 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增結(jié)果。

1.7 PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，連接pGEM－T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Amp、IPTG和X－Gal的LB平板，挑取白色菌落進行質(zhì)粒提取，并進行PCR鑒定。

1.8 序列測定及比較分析 選取3～5個PCR陽性克隆，送立菲生物技術(shù)有限公司進行序列測定。所測定的基礎(chǔ)弱毒株及在雞體內(nèi)傳代后的各個代次囊毒的序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列用DNASTAR 5.0軟件中的Megalign進行比對分析。

2 結(jié) 果

2.1 病毒在雞體內(nèi)傳代后的致病性變化 將基礎(chǔ)IBDV弱毒株A和B在雞體內(nèi)連續(xù)傳代至第5、第6代時，囊體比大幅度下降（圖1－圖3），B∶B指數(shù)下降（圖4－圖6），說明法氏囊萎縮嚴(yán)重，表明IBDV弱毒株在雞體內(nèi)傳代后毒力返強。

圖1 14、21 d時弱毒株A及其雞體傳代毒P6的囊體比

圖2 14、21 d時弱毒株B及其第一次雞體傳代毒P5的囊體比

圖3 14、21 d時弱毒株B及其第二次雞體傳代毒P6的囊體比

圖4 14、21 d時弱毒株A及其雞體傳代毒P6的B∶B指數(shù)

圖5 14、21 d時弱毒株B及其第一次雞體傳代毒P5的B∶B指數(shù)

圖6 14、21 d時弱毒株B及其第二次雞體傳代毒P6的B∶B指數(shù)

2.2 IBDV基因的擴增及克隆鑒定 以提取的基礎(chǔ)種毒及其在雞體內(nèi)傳代后各個代次囊毒的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后分別以引物 A1／A2、A3／A4、B1／B2、B3／B4 進行 PCR 擴增，得到了 1613、1726、1505和1435 bp的基因片段（圖7），與預(yù)期片段大小相符。經(jīng)PCR鑒定，得到了基因組各片段的陽性克隆（圖8）。

圖7 IBDV RT－PCR擴增結(jié)果

圖8 重組質(zhì)粒pGEM－TA的PCR鑒定結(jié)果

2.3 序列的測定及比較分析 測序結(jié)果表明，成功地測出了基礎(chǔ)種毒及在雞體內(nèi)傳代后的各個代次囊毒的基因組編碼區(qū)序列，各基因的閱讀框完整，沒有發(fā)生堿基的插入和缺失。通過對基礎(chǔ)弱毒株及其雞體傳代毒的基因序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)2株弱毒株在雞體內(nèi)連續(xù)傳代過程中，一些氨基酸位點發(fā)生了規(guī)律性變異（表2）。

表2 弱毒株在雞體內(nèi)連續(xù)傳代（P1－P5／P6）期間氨基酸的變異情況

IBDV弱毒株A在雞體的傳代過程中，基因組A片段VP5基因發(fā)生了一個堿基的突變：373（C→T），導(dǎo)致 VP5蛋白125位氨基酸 P→S的變異；VP2－VP4－VP3多聚蛋白基因發(fā)生了3個堿基的突變：339（C→T）、759（C→A）和 1899（C→T），但只有759位核苷酸的突變導(dǎo)致VP2蛋白253位氨基酸H→Q的變異，其他兩個核苷酸的突變并未引起氨基酸的變異；B片段編碼的VP1基因在雞體的傳代過程中，比較保守，并未發(fā)生任何核苷酸的突變。

IBDV弱毒株B第一次在雞體的傳代過程中，基因組A片段VP5基因發(fā)生了2個堿基的突變：238（A→G）和388（T→C），導(dǎo)致 VP5蛋白 80位氨基酸A→G和130位氨基酸C→R的變異；VP2－VP4－VP3多聚蛋白基因發(fā)生了4個堿基的突變：204（A→G）、354（T→C）、759（C→A）和 2332（G→A），其中759位核苷酸的突變導(dǎo)致VP2蛋白253位氨基酸H→Q的變異，2332位核苷酸的突變導(dǎo)致VP3蛋白778位氨基酸V→M的變異，其他兩個核苷酸的突變并未引起氨基酸的變異；B片段編碼的VP1基因在雞體的傳代過程中，比較保守，并未發(fā)生任何核苷酸的突變。

IBDV弱毒株B第二次在雞體的傳代過程中，基因組A片段VP5基因發(fā)生了2個堿基的突變：238（A→G）和 388（T→C），導(dǎo)致 VP5蛋白 80位氨基酸A→G和130位氨基酸C→R的變異；VP2－VP4－VP3多聚蛋白基因發(fā)生了5個堿基的突變：204（A→G）、354（T→C）、757（C→A）、1899（C→T）和2332（G→A），其中757位核苷酸的突變導(dǎo)致VP2蛋白253位氨基酸H→N的變異，2332位核苷酸的突變導(dǎo)致VP3蛋白778位氨基酸V→M的變異，其他三個核苷酸的突變并未引起氨基酸的變異；B片段編碼的VP1基因在雞體的傳代過程中，比較保守，并未發(fā)生任何核苷酸的突變。

3 討 論

病毒在易感動物體內(nèi)傳代后，會出現(xiàn)毒力返強現(xiàn)象。本實驗將2株IBDV弱毒株在SPF雞體內(nèi)連續(xù)傳代至第5、6代時，出現(xiàn)明顯的法氏囊萎縮、B∶B指數(shù)下降，表明IBDV弱毒株在雞體內(nèi)連續(xù)傳代后毒力返強。為進一步闡釋哪些基因位點導(dǎo)致了上述毒力的變化，本實驗測定了基礎(chǔ)弱毒株及其在雞體內(nèi)傳代后各個代次囊毒的基因組序列，通過比較分析基礎(chǔ)弱毒株及其雞體傳代毒的各基因及推導(dǎo)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)三次雞體傳代實驗的結(jié)果都出現(xiàn)VP2蛋白253位氨基酸的替換；IBDV弱毒株B在雞體內(nèi)的兩次傳代實驗出現(xiàn)了VP5蛋白80、130位氨基酸變異，VP3蛋白778位氨基酸變異，而弱毒株A在雞體的傳代過程中并未發(fā)生上述位點的變異。結(jié)果表明VP2蛋白253位氨基酸由H→Q或者H→N的變異能增強傳染性法氏囊病病毒在雞體內(nèi)的致病性。

IBDV主要侵害雞的中樞免疫器官—法氏囊，其中B淋巴細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞。經(jīng)典強毒株或者超強毒株不易在細(xì)胞上繁殖，但在細(xì)胞上連續(xù)傳代后能適應(yīng)細(xì)胞生長，并且對雞的致病性降低［4］。序列分析［5］和后來的反向遺傳學(xué)研究［6］表明 VP2高變區(qū)的幾個特定的氨基酸（253、279、284、330）與IBDV的組織適應(yīng)性及毒力相關(guān)。重組嵌合病毒的體內(nèi)外致病性實驗研究表明253Q、279D、284A參與了IBDV的毒力、細(xì)胞嗜性及致病性表型［7］。也有研究表明VP2蛋白不是IBDV超強毒株的唯一決定因子［8］。最近更多的研究表明基因組B片段編碼的VP1蛋白（依賴于RNA的RNA聚合酶）對于IBDV在雞體內(nèi)的復(fù)制效率及毒力至關(guān)重要［9］。自然重配IBDV毒株的出現(xiàn)也表明基因組B片段對于超強IBDV毒株的致病性意義重大［10］?？傊絹碓蕉嗟难芯勘砻鱅BDV的毒力是多基因共同作用的結(jié)果。

然而 Yamaguchi和 Jackwood的研究發(fā)現(xiàn)將IBDV疫苗株在雞體內(nèi)連續(xù)傳代后，VP2蛋白253位氨基酸由H突變?yōu)镚或者Q、N，并伴隨著毒力的增強；再將這些雞體傳代毒在細(xì)胞上培養(yǎng)，VP2蛋白253位氨基酸又回復(fù)突變?yōu)镠，并伴隨著毒力的喪失；然而VP2蛋白的279、284和330位氨基酸并沒發(fā)生變異，表明僅VP2蛋白253位氨基酸的替換可能會增強傳染性法氏囊病病毒在雞體內(nèi)的致病性［11－12］。 本實驗從整個基因組水平上分析，發(fā)現(xiàn)弱毒株在雞體內(nèi)傳代后，基因組B片段并未發(fā)生任何變異，VP2蛋白的279、284和330位氨基酸也沒發(fā)生變異，僅VP2蛋白253位氨基酸發(fā)生了H→Q或者H→N的替換，更有效地證明了VP2蛋白253位氨基酸對于IBDV毒力的重要性。這些實驗結(jié)果也都反映出疫苗株在田間應(yīng)用中可能存在毒力返強的危險。

晶體學(xué)研究表明每一個VP2蛋白亞單位分為base、shell和 projection 三個結(jié)構(gòu)域［13］，253 位氨基酸位于projection中的兩個親水區(qū)之間，暴露在VP2蛋白表面。盡管VP2蛋白253位氨基酸殘基的作用機制尚未明確，本文推測在該位點由組氨酸（H）變?yōu)楣劝滨０罚℅）或者天冬酰胺（N），使該區(qū)域親水性增強，可能更有利于IBDV在雞體內(nèi)與受體細(xì)胞相互作用，從而增強IBDV在雞體內(nèi)的致病性。本研究的結(jié)果表明VP2蛋白253位一個氨基酸的替換即可改變IBDV的毒力，該結(jié)果提示一個氨基酸變化就可能使弱毒株毒力返強，這對目前市場上IBDV疫苗株的安全性提出了質(zhì)疑，提示進一步加強疫苗準(zhǔn)入后的安全性評價及監(jiān)管的重要性。

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