陳麗萍 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

塞尼卡病毒A（Senecavirus A，SVA），原名塞尼卡谷病毒（Seneca valley virus，SVV）是引發(fā)豬原發(fā)性水皰病（PIVD）的主要原因，可導(dǎo)致感染豬的鼻吻、蹄冠部出現(xiàn)水皰性病變，新生仔豬死亡。近年來，SVA已經(jīng)波及美國、加拿大、巴西、泰國、中國等，危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展[1-6]。目前，國內(nèi)外仍沒有可以推廣使用的商品化SVA疫苗，疫苗制備方法的報(bào)道最早出自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所[7]。本文通過試驗(yàn)從接種方法、細(xì)胞濃度、血清含量及收毒時(shí)間等因素對SVA在BHK-21細(xì)胞中培養(yǎng)的影響，從而了解SVA在BHK-21細(xì)胞中增殖的最適條件，為疫苗生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，恒溫水浴鍋，96孔板。

1.2 試驗(yàn)試劑MEM培養(yǎng)基（購自Gibco），新生牛血清（購自潤生生物），BHK-21細(xì)胞，SVA（公司自主分離毒株），胰酶-EDTA溶液（自配）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 兩種接種方法對比試驗(yàn) 用MEM培養(yǎng)基(含8%新生牛血清)作為BHK-21細(xì)胞的營養(yǎng)液，按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞[8]。將長滿致密單層的BHK-21細(xì)胞用胰酶-EDTA消化傳代（比例為1:3），隨機(jī)將細(xì)胞分成2組，一組同步接種1% SVA；另一組待細(xì)胞生長約90%時(shí)，棄去營養(yǎng)液，異步接種1% SVA，加入MEM維持液（含2%新生牛血清）；設(shè)健康細(xì)胞作對照。接毒后細(xì)胞放37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后每3 h觀察一次，18 h后每3 h、每組隨機(jī)收獲2瓶，直至30 h，收獲后反復(fù)凍融2次，測定TCID50。

2.2 不同細(xì)胞濃度培養(yǎng)同時(shí)收獲對比試驗(yàn) 將長滿致密單層的BHK-21細(xì)胞消化后，按1:2、1:3、1:4和1:5的比例稀釋傳代，待細(xì)胞生長至90%時(shí)，棄去營養(yǎng)液，加入MEM維持液，接種1%SVA；設(shè)健康細(xì)胞作對照。接毒24 h后同時(shí)收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融2次后測定TCID50。

2.3 不同細(xì)胞濃度相同病變程度收獲病毒對比試驗(yàn) 按2.2中的條件培養(yǎng)SVA，當(dāng)CPE達(dá)80%以上時(shí)收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融2次后測定TCID50。

2.4 不同時(shí)間收獲對SVA增殖的影響 將長滿致密單層的BHK-21細(xì)胞消化后，按1:3、1:4比例傳代，每組18瓶，待細(xì)胞生長約90%時(shí)，棄去營養(yǎng)液，加入MEM維持液，接種1%SVA；設(shè)健康細(xì)胞作對照。從15 h起每3 h、每組隨機(jī)收獲2瓶觀察病變情況，觀察至39 h。反復(fù)凍融2次，測定TCID50。

2.5 不同血清含量培養(yǎng)的細(xì)胞接種SVA比較試驗(yàn)將長滿致密單層的BHK-21細(xì)胞消化后，按1:3、1:4比例傳代，分別用血清含量為5%、8%、10%的MEM培養(yǎng)，細(xì)胞生長至90%時(shí)，棄去營養(yǎng)液，加入MEM維持液，接種1%SVA；設(shè)健康細(xì)胞作對照。當(dāng)CPE達(dá)80%以上收獲病毒，反復(fù)凍融2次后測定TCID50。

2.6病毒TCID50測定 將BHK-21細(xì)胞按一定比例消化后鋪于96孔板中，0.1 mL/孔，放CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后接毒。將待檢病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋，取10-7、10-8、10-9三個(gè)稀釋度分別接種到培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度6孔，0.1 mL/孔；設(shè)6孔無病毒空白對照，加入MEM維持液，0.1 mL/孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察并記錄每孔細(xì)胞的CPE，采用Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

3 結(jié) 果

3.1 兩種接種方法對SVA的影響 從病變來看，異步接毒在接毒15 h病變較輕，18 h病變明顯，24 h病變達(dá)80%以上；同步接毒在接毒15 h病變已經(jīng)很明顯，18 h大量細(xì)胞已經(jīng)脫落，病變達(dá)80%以上?？梢?，異步接毒收獲病毒液的TCID50明顯比同步接種的高（見圖1）。

圖1 兩種接種方法對比試驗(yàn)結(jié)果

3.2 不同細(xì)胞濃度同時(shí)收獲對SVA增殖的影響細(xì)胞接種SVA后，培養(yǎng)24 h同時(shí)收獲病毒。由圖2可見，1:2、1:3比例傳代時(shí)，收獲病毒液的TCID50都相對較高；1:4、1:5比例傳代時(shí)，收獲病毒液的TCID50都相對較低。1:3比例傳代細(xì)胞培養(yǎng)的病毒液的TCID50最高。

圖2 不同細(xì)胞濃度對SVA增殖的影響

3.3 不同細(xì)胞濃度相同病變收獲對SVA增殖的影響 細(xì)胞以不同比例傳代后接種病毒，從CPE來看，1:5比例傳代時(shí)最早出現(xiàn)病變，接種后18 h CPE已達(dá)80%以上；1:4比例傳代時(shí)，接種后21 h CPE已達(dá)80%以上；1:3比例傳代時(shí)，則在接種后24 h CPE達(dá)80%以上；1:2比例傳代時(shí)，30 h CPE達(dá)到80%以上。從圖2可見，1:5比例傳代時(shí)，收獲病毒液的TCID50都相對較低，1:2、1:3、1:4比例傳代細(xì)胞培養(yǎng)的病毒液的TCID50都比較高。

3.4 不同時(shí)間收獲對SVA增殖的影響 從CPE來看，1:4傳代時(shí)，接毒后15 h已經(jīng)出現(xiàn)明顯病變，21 h、24 h CPE達(dá)80%以上，33 h細(xì)胞大部分都已脫落；1:3傳代時(shí)，接毒后18 h出現(xiàn)明顯病變，24 h、27 h CPE達(dá)80%以上，36 h細(xì)胞大部分都已脫落。由圖3可見，1:4傳代時(shí)，在CPE達(dá)80%以上且TCID50最高的時(shí)間段為21~27 h；1:3傳 代 時(shí)，CPE達(dá)80%以上且TCID50最高的時(shí)間段為24~30 h。

圖3 不同收獲時(shí)間對SVA增殖的影響

3.5 不同血清含量培養(yǎng)的細(xì)胞對SVA增殖的影響從圖4可知，傳代比例為1:4時(shí)，8%血清培養(yǎng)病毒液的TCID50最高；傳代比例為1:3時(shí)，8%、10%血清培養(yǎng)病毒液的TCID50都比較高，血清含量增加收獲病毒液的TCID50也增加?？偟膩碚f，培養(yǎng)液的營養(yǎng)水平與收獲病毒液的TCID50呈正相關(guān)。

圖4 不同血清含量比對試驗(yàn)

4 討 論

體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖病毒時(shí)，接種時(shí)間是病毒增殖效果的重要因素[8-9]。本試驗(yàn)將SVA以不同接種方法接種BHK-21細(xì)胞，結(jié)果表明異步接毒收獲病毒液的TCID50高于同步接毒收獲病毒液。細(xì)胞濃度會影響病毒的繁殖，從而影響收獲病毒的TCID50。以1:5傳代的細(xì)胞，培養(yǎng)病毒的含量較低，而細(xì)胞傳代比例為1:2～1:4的，培養(yǎng)病毒的含量較高，而1:2傳代影響生產(chǎn)效率且成本高，整體來看，1:3比例傳代培養(yǎng)SVA病毒，效價(jià)較高。

營養(yǎng)液中的血清含量不僅是培養(yǎng)液營養(yǎng)水平的重要體現(xiàn)，還對細(xì)胞生長、病毒增殖至關(guān)重要。營養(yǎng)水平會影響細(xì)胞的長速、周期、狀態(tài)，從而影響病毒增殖。試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用5%血清培養(yǎng)，病毒含量都偏低，用8%、10%血清培養(yǎng)，TCID50都比較高，但考慮到血清成本較高，用8%血清含量比較適宜。

病毒的收獲時(shí)間是病毒液能否在TCID50高點(diǎn)收獲的關(guān)鍵因素，直接影響病毒的效價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，同等條件下，CPE達(dá)80%以上時(shí)收獲病毒液的TCID50高于接種病毒后24 h同時(shí)收獲病毒液的TCID50。

因此，根據(jù)對SVA培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，SVA在BHK-21細(xì)胞上的適宜培養(yǎng)條件為細(xì)胞1:3比例傳代、添加8%新生牛血清培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90%比例時(shí)接種SVA，接種后培養(yǎng)至CPE達(dá)到80%以上收獲病毒。