梁素鈺　李琳　杜倩等

摘要[目的]對開墾荒地種植橡膠草前后的土壤微生物細(xì)菌多樣性進行454測序技術(shù)并對基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進行分析，探求利用邊際土地進行戰(zhàn)略能源作物種植的可行性。[方法]通過蛇形取樣法對土壤樣品采集、用試劑盒提取土壤微生物總DNA、選擇細(xì)菌16SrDNA V3～V1區(qū)，進行引物設(shè)計與PCR預(yù)擴增，采用454測序技術(shù)獲得數(shù)據(jù)序列并優(yōu)化，用R軟件進行指數(shù)多樣性等基礎(chǔ)分析。[結(jié)果]樣品總DNA無蛋白質(zhì)和RNA污染，PCR預(yù)擴增出500 bp左右的細(xì)菌16S rDNA。454測序序列優(yōu)化序列占有效序列的90%以上，在97%相似性水平下的指數(shù)多樣性顯示橡膠草種植后土壤細(xì)菌OTU數(shù)目較多；ShannonWiener曲線和稀釋性曲線顯示，當(dāng)測序序列細(xì)菌超過15 000時曲線趨向平坦。[結(jié)論]試驗測序數(shù)據(jù)可以反應(yīng)樣品中絕大多數(shù)微生物信息，此次取樣的數(shù)量比較合理，細(xì)菌豐富度高。

關(guān)鍵詞橡膠草（Taraxacum koksaghyz Rodin）；454測序；細(xì)菌；多樣性；土壤微生物

中圖分類號S576文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）09-02563-02

基金項目國家林業(yè)局948，編號201304SC2，2011451；黑龍江省財政，編號201102；黑龍江省森工總局，編號sgzjY2012010；黑龍江省博士后，編號LBHQ10010）。

作者簡介梁素鈺（1970- ），女，黑龍江哈爾濱人，副研究員，博士，從事生物能源與技術(shù)研究。

橡膠草（Taraxacum koksaghyz Rodin）是菊科（Compositae）蒲公英屬（Taraxacum）多年生宿根草本產(chǎn)膠植物，首先于20世紀(jì)30年代在前蘇聯(lián)被發(fā)現(xiàn)，并對橡膠草體內(nèi)橡膠的形成[1-2]及品質(zhì)變化[3-4]、體內(nèi)碳水化合物[5-6]、果聚糖[7]、多酚氧化酶及化合物[8-9]和脫氫酶[10]等進行了研究。中國在20世紀(jì)50年代初，為解決國內(nèi)天然橡膠供應(yīng)不足問題，中央輕工業(yè)部曾組織調(diào)查團前往新疆對發(fā)現(xiàn)的大面積野生橡膠草進行全面考查[11-12]。

近年來，隨著橡膠草作為替代巴西橡膠的可用資源之一[13-17]，人們對橡膠草的研究維度更加多樣化，從田間種植[18]，組織培養(yǎng)[19-22]、到分子水平的蛋白質(zhì)[23-24]、轉(zhuǎn)基因[25-27]、遺傳圖譜多樣性[28]和基因克隆[29-30]等進行了一系列的研究。筆者主要是利用454技術(shù)[31-32]研究北方田間種植橡膠草前后的土壤微生物細(xì)菌的多樣性，并對所測序列進行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析，以期為橡膠草的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料于種植1年橡膠草的土地和未種植地，以5 m×5 m為試驗單元，盡量靠近橡膠草根蛇形取土樣5個，每個樣品50.0 g，混合，過40目土壤篩。樣品用錫紙包裹，置于液氮中帶回實驗室。試驗中用KOK表示橡膠草種植后的樣本，用CK表示橡膠草種植前的樣本。

1.2方法

1.2.1土壤總基因組的提取與純化。利用土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）進行微生物基因組DNA的提取和純化，土樣取0.25 g，提取完成后，取1 μg DNA上樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2454測序進行PCR擴增時引物選擇。檢測細(xì)菌選擇16SrDNA V3～V1區(qū)，進行引物設(shè)計與PCR擴增。擴增引物為 27F：5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3；533R：5TTACCGC GGCTGCTGGCAC3（測序端）。

1.2.3有效序列數(shù)據(jù)及優(yōu)化序列數(shù)據(jù)。對2個樣品混合測序后，去除測序接頭、barcode和前引物（forward primer）序列，并對處理后的有效序列和優(yōu)化序列數(shù)據(jù)進行分布統(tǒng)計。

1.2.4OTU聚類分析。對所測細(xì)菌序列進行歸類操作，按照彼此的相似性歸為許多小組，1個小組就是1個OTU（Operational Taxonomic Units，可操作的分類單元），來自1個菌。試驗基于97%的相似度，對所有細(xì)菌序列進行OTU聚類并進行生物信息統(tǒng)計分析。

1.2.5多樣性分析。試驗使用R軟件，應(yīng)用菌群豐度指數(shù)Chao、Ace，菌群多樣性指數(shù)Simpson、Shannon和測序深度指數(shù)Coverage和ShannonWiener曲線反應(yīng)樣品的微生物多樣性指數(shù)，用稀釋性曲線比較測序數(shù)量不同的樣本物種的豐富度和樣本的取樣大小。

2結(jié)果與分析

2.1DNA的提取與PCR擴增圖1表明，2個樣品均獲得質(zhì)量良好的總DNA，無蛋白質(zhì)和RNA污染，可進行PCR擴增。細(xì)菌PCR均預(yù)擴增出500 bp左右的條帶，無拖尾現(xiàn)象。

注：M為DL2000；90為KOK；100為CK；（a）為樣品總DNA；（b）為細(xì)菌16srDNA PCR。

2.2樣品序列數(shù)據(jù)的分析由表1可知，優(yōu)化后的序列長度占有效序列的90%以上，滿足試驗分析要求。

2.3橡膠草土壤細(xì)菌多樣性分析

2.3.2ShannonWiener曲線分析。圖2表明，這2個樣本的曲線離得比較近，當(dāng)細(xì)菌測序序列超過15 000時，曲線趨向平坦，說明試驗選取細(xì)菌測15 000條序列時能反應(yīng)樣品中絕大多數(shù)微生物信息，所測序的數(shù)據(jù)具有高的可信度，可真實地反應(yīng)試驗結(jié)果。

2.3.3稀釋性曲線（rarefaction curve）分析。該分析是在97%相似性水平下劃分OTU并制作樣品的稀疏曲線，當(dāng)細(xì)菌達(dá)到15 000，曲線有趨向平坦趨勢，說明此次取樣的數(shù)量比較合理（圖3）。注：90為KOK；100為CK。

3結(jié)論與討論

試驗主要針對土壤樣品的采集、DNA的提取、PCR預(yù)處理以及獲得樣品的測序數(shù)據(jù)進行的基礎(chǔ)分析。用454技術(shù)研究土壤微生物，在土壤樣品的準(zhǔn)備上，為了盡可能接近土壤內(nèi)真實微生物的組成，在取樣時第一時間將樣品原地處理后，存于液氮中保存。但在試驗過程中，DNA的提取、純化以及PCR引物的設(shè)計和擴增，都會對所測序列產(chǎn)生影響。該試驗中的PCR是預(yù)試驗，主要目的是為了檢測基因組DNA是否可以進行后續(xù)的454測序。

序列優(yōu)化是為了去除測序過程中出現(xiàn)的冗余數(shù)據(jù)，其中不含所設(shè)計序列的數(shù)據(jù)不可用于后續(xù)分析。試驗數(shù)據(jù)分析是在0.03水平上，即97%相似性，選取數(shù)據(jù)并進行分析。在分析過程中，也可以根據(jù)需要選取0.1或者0.01等不同程度的相似性水平所獲得的數(shù)據(jù)，那就要看實際優(yōu)化的序列是否可以滿足試驗分析要求。