楊晶晶　陳麗華　李興玉　吳毅歆　陳映嵐　何月秋

摘要[目的]研究化學(xué)誘變枯草芽孢桿菌對(duì)大白菜根腫病的防治效果。[方法]采用3株來(lái)自枯草芽孢桿菌XF1的化學(xué)誘變菌株XF1A、XF1C和XF1E進(jìn)行大白菜根腫病的盆栽防病試驗(yàn)，并以MALDITOFMS分析了3種抗生素的相對(duì)含量。[結(jié)果]菌株XF1A和XF1C防效較好，分別為68.80%和65.06%，XF1E防效較差為42.21%。3菌株均能分泌表面活性素、伊枯草菌素和豐源素，但表面活性素和伊枯草菌素相對(duì)含量為XF1A>XF1C>XF1E，XF1A的表面活性素和伊枯草菌素分別達(dá)29.26%和35.31%，XF1E的豐源素含量最高，達(dá)41.09%。[結(jié)論]表面活性素和伊枯草菌素含量與對(duì)根腫病防治效果存在一定的關(guān)聯(lián)性

關(guān)鍵詞根腫??；表面活性素；伊枯草菌素；豐源素

中圖分類(lèi)號(hào)S432.4+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）09-02597-03

基金項(xiàng)目農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201003029）；云南省支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2009EB060）。

作者簡(jiǎn)介楊晶晶（1985- ），男，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向：植物病害可持續(xù)管理。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事病害可持續(xù)控制方面的研究。

十字花科根腫病是由蕓苔根腫菌侵染引起的病害[1]。該菌主要侵染十字花科植物根部，在根部組織中產(chǎn)生細(xì)胞分裂素和吲哚乙酸等物質(zhì)，引起根部薄壁細(xì)胞大量分裂和增生，從而形成腫瘤，植株地上部出現(xiàn)矮化、失水、萎蔫直至死亡，根部出現(xiàn)根瘤狀物[2-6]。某些枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，以伊枯草菌素（Iturin）、表面活性素（surfactin）、豐源素（fengycin）三大家族為主[7]。伊枯草素能夠影響細(xì)胞膜的表面張力，增加生物分子脂質(zhì)膜的導(dǎo)電性[8]，導(dǎo)致微孔的形成、K+及其他重要離子的滲漏，最后引起細(xì)胞死亡[9]，具有較強(qiáng)的抗真菌活性[10]，也有部分抑制細(xì)菌的作用[11]；表面活性素具有抗病毒、抗腫瘤、抗支原體和抗細(xì)菌活性[12]；豐源素能抑制真菌生長(zhǎng)，尤其對(duì)絲狀真菌抑制活性最強(qiáng)[13]。

由于根腫病防治較難，目前田間防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥，但因化學(xué)農(nóng)藥對(duì)土壤環(huán)境有負(fù)面影響，且不宜長(zhǎng)期使用。為尋找有效、更安全的防治方法，筆者開(kāi)展了3株化學(xué)誘變的枯草芽孢桿菌盆栽防病試驗(yàn)，同時(shí)測(cè)定其抗生素類(lèi)含量。

1材料與方法

1.1菌株來(lái)自防治根腫病效果較好的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XF1化學(xué)誘變菌株XF1A、XF1C、XF1E和云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)國(guó)家工程中心保存的三七根腐病菌（Fusarium soloni）以及田間采回的活體根腫病菌。

1.2試劑與材料乙腈（ACN）（色譜純），三氟醋酸（TFA）（色譜純），α氰基4羥基肉桂酸（CHCA）（色譜純），重蒸水，白菜種子（青島831），花盆（上口直徑15.0 cm，下口直徑10.5 cm，高12.5 cm）。

質(zhì)譜儀：Bruker Autoflex Speed MALDITOFMS（Bruker Daltonics，Billerica，MA，USA）。

提取溶劑：70 ml乙腈，0.1 ml TFA，用重蒸水定容至100 ml。

輔助基質(zhì)溶液配制：常溫下用提取溶劑溶解CHCA配成飽和溶液。

1.3枯草芽孢桿菌抑菌試驗(yàn) （1）挑取三七根腐菌絲塊接于PD培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h（28 ℃，140 r/min），將培養(yǎng)菌液稀釋100倍，取100 μl稀釋的菌液涂布于PDA平板上，再接種單菌落的芽孢桿菌，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，觀察抑菌結(jié)果。

（2）將試驗(yàn)菌株單菌落接種于4瓶250 ml LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)72 h（37 ℃，150 r/min），25 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液1 000 ml，加入硫酸銨至80%飽和度，4 ℃沉淀24 h，收集沉淀冷凍干燥，稱(chēng)取冷凍干燥的提取物0.1 g加入900 μl無(wú)菌水溶解。將培養(yǎng)72 h的三七根腐菌稀釋100倍，取100 μl涂布于PDA 培養(yǎng)基上，用直徑6 mm打孔器打孔，在孔中加入提取物的水溶液20 μl，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。

1.4盆栽試驗(yàn)

1.4.1白菜種植。采集不含根腫孢子的耕作層土壤，加入草炭和珍珠巖混拌均勻（土壤∶草炭∶珍珠巖= 2∶1∶1），稱(chēng)取1 000 g置入直徑15 cm的花盆中，同時(shí)稱(chēng)取3 g新鮮根腫組織，加50 ml無(wú)菌水，以水果榨汁勻漿機(jī)打碎，加入無(wú)菌水至體積為100 ml混勻，澆灌于上述準(zhǔn)備的土壤表面，待花盆表面土層水分滲透后，疏松土壤表面，并均勻播種25粒感病大白菜品種“青島831”種子，覆土約1 cm。

1.4.2處理設(shè)計(jì)與栽培管理。設(shè)4個(gè)處理，分別為XF1A、XF1C、XF1E和空白對(duì)照（CK），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。各試驗(yàn)菌株分別于250 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，然后分別稀釋5倍（約107個(gè)/ml），取100 ml均勻澆入盆中，CK以LB培養(yǎng)液稀釋5倍澆入。每隔4 d澆菌液1次，共澆5次。在第5和10天間苗，最終每盆中保留14苗。

1.4.3病情調(diào)查。35 d采收大白菜，將所有的白菜拔起，用水清洗根部泥土，根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[14]調(diào)查根腫病的發(fā)生情況。

盆栽苗期病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：根部無(wú)腫瘤；1級(jí)：僅側(cè)根腫大，側(cè)根有小腫瘤；3級(jí)：主根腫大，其直徑小于2倍莖基部；5級(jí)：主根腫大，其直徑是莖基部的2～3倍；7級(jí)：主根腫大，其直徑是莖基部的3～4倍；9級(jí)：主根腫大，其直徑是莖基部的4倍以上，或腫瘤龜裂。

病情指數(shù)=（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)病級(jí)數(shù)）調(diào)查總數(shù)×9×100

防治效果（%）=對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)對(duì)照病情指數(shù)×100

1.5MALDITOFMS檢測(cè)挑取各生防菌20個(gè)單菌落分別裝于2 ml離心管中，各加入1 ml提取溶劑，振蕩2 min后在12 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，取上清液分別裝于1.5 ml離心管中保存于4 ℃冰箱中。取2 μl細(xì)胞表面提取液于目標(biāo)板孔靶上，加等體積的輔助基質(zhì)混勻，自然風(fēng)干后進(jìn)行MALDITOFMS檢測(cè)。儀器參數(shù)為反謝操作模式；正離子檢測(cè)；檢測(cè)范圍100～2 000 Da；激光點(diǎn)擊數(shù)每圖譜50；激光頻率30.0 Hz；離子源加速電壓20 kV；反謝電壓23.5 kV脈沖離子。

2結(jié)果與分析

2.13個(gè)菌株的抑菌活性菌株和其代謝產(chǎn)物對(duì)三七根腐病菌的抑菌結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，枯草芽孢桿菌XF1A、XF1C和XF1E對(duì)三七根腐病菌有較強(qiáng)的拮抗作用，培養(yǎng)3 d后形成透明的抑菌圈，抑菌圈大小為1.2～1.4 cm，3個(gè)菌株的抑菌作用較菌株XF-1增強(qiáng)；發(fā)酵菌株的上清液對(duì)三七根腐病菌的拮抗作用優(yōu)于野生菌株XF1。注：1為接菌株，2、3、4分別為菌株提取液。

2.3MALDITOFMS檢測(cè)枯草芽孢桿菌的次生代謝物3株枯草芽孢桿菌細(xì)胞表面提取物經(jīng)MALDITOFMS檢測(cè)，證明它們均能分泌表面活性素、伊枯草菌素和豐源素，且這3類(lèi)環(huán)脂肽化合物為3菌株細(xì)胞表面提取物的主要成分。但3類(lèi)物質(zhì)在各菌株中的相對(duì)含量不同（圖3），其中表面活性素和伊枯草菌素相對(duì)含量為XF1A>XF1C>XF1E，XF1A的表面活性素和伊枯草菌素最高，分別為29.26%和35.31%，XF1E的豐源素最高，高達(dá)41.09%。

3討論

由于根腫病菌不能在人工培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該研究采用三七根腐病菌為指示菌。在3株化學(xué)誘變的枯草芽孢桿菌拮圖2枯草芽孢桿菌處理后大白菜根腫病癥狀圖33個(gè)菌株環(huán)肽抗生素含量抗真菌的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)菌株及其發(fā)酵液提取物對(duì)三七根腐病菌均具有拮抗作用，且較野生型菌株XF-1有明顯提高。大白菜根腫病的盆栽防治試驗(yàn)結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌XF1A和XF1C對(duì)根腫病的防治效果較好，XF1E的防治效果較差。分析防病效果與三七根腐病菌（F.solani）的拮抗作用，兩者之間沒(méi)有直接的聯(lián)系，即拮抗能力強(qiáng)的菌株不一定對(duì)根腫病有較好的防效。這可能與三七根腐病菌同十字花科作物根腫病菌形態(tài)結(jié)構(gòu)等存在差異有關(guān)。因此，盡管三七根腐病菌具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)孢量大、同根腫病菌細(xì)胞壁由幾丁質(zhì)組成等優(yōu)點(diǎn)，但在篩選防治根腫病的生防菌株時(shí)，在得到大量具抑菌作用的生防菌株后，應(yīng)以根腫病菌作為靶標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，以提高篩選優(yōu)良生防菌株的工作效率和降低成本。MALDITOFMS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物有較大的變化，菌株XF1A和XF-1C代謝物中表面活性素和伊枯草菌素的相對(duì)含量較高，防病效果較好，而菌株XF1E代謝物中表面活性素和伊枯草菌素的相對(duì)含量較低，防病效果差。

3突變菌株代謝物伊枯草菌素、表面活性素和豐源素相對(duì)含量變化差異明顯，但有一共同的趨勢(shì)：伊枯草菌素和表面活性素相對(duì)含量較高時(shí)，豐源素的相對(duì)含量較低（突變菌株XF1A和XF1C）；豐源素相對(duì)含量較高時(shí)，伊枯草菌素和表面活性素相對(duì)含量較低（突變菌株XF1E）。董偉欣等[15]研究NCD2菌株發(fā)現(xiàn)，脂肽提取物中主要為豐源素，缺失fenC基因的突變子喪失了豐源素的合成能力，但突變子中產(chǎn)生了一種與桿菌霉素D（bacillomycin D）具有一致分子量的新物質(zhì)。李興玉[16]檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌B9601Y2代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其豐源素相對(duì)含量高達(dá)68.75%，但沒(méi)有檢測(cè)到表面活性素，檢測(cè)到少量的伊枯草菌素，該菌株對(duì)多種真菌具有較強(qiáng)拮抗作用。在野生XF1菌株中豐源素相對(duì)含量較高，伊枯草菌素和表面活性素相對(duì)含量較低，其中伊枯草菌素的相對(duì)含量遠(yuǎn)低于豐源素[16]。比較分析的結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中豐源素類(lèi)物質(zhì)的合成影響伊枯草菌素的合成，兩者呈負(fù)相關(guān)，即當(dāng)菌株豐源素產(chǎn)物的相對(duì)含量提高時(shí)，伊枯草菌素產(chǎn)物的相對(duì)含量降低。

參考文獻(xiàn)

[1] 孫保亞，沈向群，郭海峰，等.十字花科植物根腫病及抗病育種研究進(jìn)展[J].中國(guó)蔬菜，2005（4）：34-37.

[2] 張琴.根腫病防治藥劑的篩選和防治研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[3] 周俊.十字花科作物根腫病發(fā)生規(guī)律及防治[J].植物醫(yī)生，2011，24（6）：42-43.

[4] 鐘源.十字花科根腫病的發(fā)生規(guī)律油菜抗性鑒定及生物防治研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[5] 司軍，李成瓊，任雪松，等.十字花科植物根腫病及抗根腫病育種研究進(jìn)展[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002（15）：69-72.

[6] 蘇珍琴.十字花科蔬菜根腫病的防治技術(shù)[J].西昌農(nóng)業(yè)科技，2010（1）：22-23.

[7] KIM P，BAI H，BAI D，et al.Purification and characterization of a lipopeptide produced by Bacillus thuringiensis CMB26[J].Journal of Applied Microbiology，2004，97：942-949.

[8] TANAKA Y，TOJO T，UCHIDA K，et al.Method of producing iturin A and antifungal agent for profound mycosis[J].Biotechnology Advances，1997，15：234-235.

[9] 李德全，陳志誼，聶亞鋒.生防菌Bs-916及高效突變菌株抗菌物質(zhì)及其對(duì)水稻抗性誘導(dǎo)作用的研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2008，38（2）：192-198.

[10] STEIN T.Bacillus subtilis antibiotics：structures，syntheses and specific functions[J].Molecular Microbiology，2005，56（4）：845-857.

[11] 黃現(xiàn)青.Bacillus subtilis fmbJ 產(chǎn)生的脂肽抗微生物效果及安全性評(píng)價(jià)[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[12] KRACHT M，ROKOS H，OZEL M，et al.Antiviral and hemolytic activities of surfactin isoforms and their methyl ester derivatives[J].The Journal of Antibiotics，1999，52：613-619.

[13] DELEU M，PAQUOT M，NYLANDER T.Effect of Fengycin，a Lipopeptide Produced by Bacillus subtilis，on Model Biomembranes[J].Biophysical Journal，2008，94（7）：2667-2679.

[14] 吳道軍，陳國(guó)康，楊曉琴，等.4種甘藍(lán)根腫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26（2）：591-594.

[15] 董偉欣，李寶慶，李社增，等.脂肽類(lèi)抗生素fengycin 在枯草芽胞桿菌 NCD-2 菌株抑制番茄灰霉病菌中的功能分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2013，43（4）：401-410.