付強(qiáng)　鄭昭芬　彭建強(qiáng)　何晉　王照飛

【摘要】 從外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞（MNCs），種植在纖維連接蛋白（Fn）包被的六孔板，以EGM-2培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)第4天，全量換液后可見(jiàn)梭形或多角形貼壁細(xì)胞，鏡下可見(jiàn)多個(gè)呈“血島”樣生長(zhǎng)的細(xì)胞集落，集落中間為聚集成簇的圓形細(xì)胞，周邊環(huán)繞放射狀梭形細(xì)胞。培養(yǎng)初始2周，梭形細(xì)胞首尾相連呈條索樣生長(zhǎng)或兩排細(xì)胞平行排列呈管樣生長(zhǎng)，并可見(jiàn)條索樣或管樣排列的細(xì)胞相互交錯(cuò)成網(wǎng)。培養(yǎng)至第3周，細(xì)胞呈現(xiàn)為鋪路石樣外觀；經(jīng)傳代后具有次級(jí)集落形成能力。流式細(xì)胞術(shù)顯示內(nèi)皮組細(xì)胞（EPCs）表面標(biāo)志物CD34，KDR呈陽(yáng)性，而單核、巨噬細(xì)胞系表面標(biāo)志物CD14無(wú)表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡下，EPCs具有攝取Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1的能力。

【關(guān)鍵詞】 單個(gè)核細(xì)胞；內(nèi)皮祖細(xì)胞；細(xì)胞形態(tài)學(xué)；細(xì)胞表型

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.05.013 文章編號(hào)：1004-7484（2014）-05-2417-02

1 材料與方法

1.1 材料 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)螅姿峋彌_鹽溶液（PBS）、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素購(gòu)自Hyclone，EGM-2購(gòu)自Lonza，胰蛋白酶購(gòu)自Amresco，人纖維連接蛋白（HFN）購(gòu)自merck，DiI-acLDL購(gòu)自Molecular probes，F(xiàn)ITC-UEA-I、Galetin購(gòu)自Sigma，PerCP/Cy5.5-KDR、PerCP/Cy5.5-IgG購(gòu)自BioLegend，PE-CD34、PE-IgG、FITC-CD34、FITC-IgG購(gòu)自Beckerman。外周學(xué)取自本課題組志愿者。

1.2 方法

1.2.1 密度梯度離心法分離人外周血MNCs及其誘導(dǎo)培養(yǎng)

1.2.1.1 采集人外周血25ml至含枸櫞酸鈉的50ml離心管 然后將抗凝血用PBS等倍稀釋?zhuān)粚⑾♂尯蟮目鼓c人淋巴細(xì)胞分離液按1：1的比例沿離心管壁緩慢置于淋巴細(xì)胞分離液上，4℃、400g離心30min；離心后分為4層：上層為血漿、血小板和PBS，中層為淋巴細(xì)胞分離液，底層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層與上層交界呈混濁的白膜層為MNCs層；用移液槍吸取MNCs層收集于新的50ml離心管中，用適量PBS洗滌兩遍；洗滌條件為：4℃、250g離心10min。

1.2.1.2 接種前預(yù)先將6孔板用50ug/mlFn包被24小時(shí)（5μg/cm2），接種時(shí)吸棄Fn，用PBS洗滌2次；用EGM-2誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10%FBS和100U/ml青鏈霉素）重懸MNCs；用EGM-2誘導(dǎo)培養(yǎng)液調(diào)整其濃度至5×106個(gè)/mL，接種至6孔板中，每孔加2mL，置于37℃，5%CO2，濕度大于95%下培養(yǎng)；4天后首次更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后根據(jù)營(yíng)養(yǎng)狀況每周換液2-3次，相差顯微鏡下觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)特征。

1.2.1.3 待細(xì)胞融合約80%時(shí) 棄盡舊培養(yǎng)液，用2mlPBS洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA200μL消化約1min，倒置顯微鏡下觀察，若細(xì)胞胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞變圓，立即用EGM-2培養(yǎng)液2mL終止消化，輕柔吹打混勻細(xì)胞；吸取細(xì)胞懸液置入15mL離心管中，用PBS稀釋至15mL，4℃下100g離心5min，洗滌后加入EGM-2培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×104/cm2的接種密度進(jìn)行傳代，根據(jù)營(yíng)養(yǎng)狀況每周換液2-3次。

1.2.2 人外周血EPCs的鑒定

1.2.2.1 EPCs表型流式細(xì)胞術(shù)鑒定 第二代細(xì)胞培養(yǎng)至約80%融合時(shí)消化至加入1mlPBS的EP管中，250g離心5min洗滌細(xì)胞；用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×107/ml，取100ul細(xì)胞混懸液置于編號(hào)（A，a-C，c）的EP管中；A-C管中分別加入下述直標(biāo)抗體10ul：鼠抗人PE-CD34、鼠抗人PerCP/Cy5.5-KDR、鼠抗人FITC-CD14，同型對(duì)照a-c管中加入等量各自熒光標(biāo)記的鼠IgG，室溫避光孵育1h；孵育完畢后各管加入PBS500u1，250g，離心5min，用500u1PBS重懸、混勻后，AccuriC6流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.2.2 EPCs攝取Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1的功能鑒定 細(xì)胞接種前將圓形蓋玻片浸于含200μlGaletin的24孔板中，孵育過(guò)夜；次日吸棄Galetin，消化第二代細(xì)胞，傳代接種至24孔板中蓋玻片上，根據(jù)營(yíng)養(yǎng)狀況及時(shí)更換培養(yǎng)基；待細(xì)胞融合約50%時(shí)吸棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，避光加入含Di1-ac-LDL（10ug/mL）的培養(yǎng)液200ul，置于37℃，5%C02，95%濕度下孵育4小時(shí)；孵育完畢吸棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，加入4%多聚甲醛固定30min；吸棄4%多聚甲醛，PBS漂洗3次，避光加入FITC-UEA-1（10ug/mL）200ul，置于37℃，5%C02，95%濕度下1小時(shí)。滴少量Fluorescence Mounting Medium于載玻片上，用鑷子小心將蓋玻片夾出，PBS浸洗3次，吹干后覆蓋于載玻片上，激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

2 結(jié)果

2.1 EPCs形態(tài)學(xué)特征 外周血MNCs誘導(dǎo)培養(yǎng)第4天，全量換液后可見(jiàn)梭形或多角形貼壁細(xì)胞（圖1A），鏡下可見(jiàn)多個(gè)呈“血島”樣生長(zhǎng)的細(xì)胞集落，集落中間為聚集成簇的圓形細(xì)胞，周邊環(huán)繞放射狀梭形細(xì)胞（圖1B）。誘導(dǎo)培養(yǎng)初始2周，梭形細(xì)胞形態(tài)逐漸變細(xì)長(zhǎng)，數(shù)量逐漸減少，未表現(xiàn)出明顯的增殖能力，期間可見(jiàn)細(xì)胞首尾相連呈條索樣生長(zhǎng)或兩排細(xì)胞平行排列呈管樣生長(zhǎng)，并可見(jiàn)條索樣或管樣排列的細(xì)胞相互交錯(cuò)成網(wǎng)（圖1C）。誘導(dǎo)培養(yǎng)至第3周，細(xì)胞呈現(xiàn)為鋪路石樣外觀；經(jīng)傳代后橢圓形細(xì)胞具有次級(jí)集落形成能力（圖1D）；傳代后細(xì)胞增殖迅速，3-4天細(xì)胞即融合成片。

2.2 EPCs的鑒定

2.2.1 EPCs表型流式細(xì)胞術(shù)鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EPCs的表面標(biāo)志，結(jié)果顯示CD34，KDR呈陽(yáng)性，而CD14無(wú)表達(dá)。

2.2.2 EPCs攝取Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1的功能鑒定 激光共聚焦顯微鏡下，EPCs胞吞Dil-ac-LDL入胞漿，可見(jiàn)圍繞胞核呈紅色熒光的內(nèi)吞泡；胞膜結(jié)合FITC-UEA-1，呈現(xiàn)為綠色熒光，并胞吞入胞漿與攝取的Dil-ac-LDL共同呈現(xiàn)為黃色熒光。

3 討論

分析認(rèn)為這些單核巨噬系細(xì)胞促進(jìn)血管新生的機(jī)制在于其旁分泌功能，即通過(guò)分泌促血管生成的細(xì)胞因子刺激EPCs成血管。因此也被稱(chēng)為循環(huán)促成血管細(xì)胞（circulating angiogenic cells，CACs）。由此可見(jiàn)，不論是貼壁還是非貼壁細(xì)胞，經(jīng)這些方法誘導(dǎo)培養(yǎng)后，都具有內(nèi)皮細(xì)胞的一些特征，并參與血管新生，但卻不直接形成新生血管。

我們將外周血MNCs誘導(dǎo)培養(yǎng)第4天后可見(jiàn)梭形或多角形貼壁細(xì)胞（圖1A），鏡下可見(jiàn)多個(gè)呈“血島”樣生長(zhǎng)的細(xì)胞集落，集落中間為聚集成簇的圓形細(xì)胞，周邊環(huán)繞放射狀梭形細(xì)胞（圖1B）。表現(xiàn)出早期EPCs的形態(tài)特征。本研究誘導(dǎo)培養(yǎng)第3周，成功獲得了鋪路石樣細(xì)胞；經(jīng)傳代后具有次級(jí)集落形成能力（圖1D）；該細(xì)胞增殖迅速，3-4天細(xì)胞即融合成片，表現(xiàn)為晚期EPCs的形態(tài)特征。隨后我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞的表面標(biāo)志，結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34，KDR呈陽(yáng)性，而單核、巨噬細(xì)胞系表面標(biāo)志物CD14無(wú)表達(dá)（圖2）；與上文所述的晚期EPCs特征相符。最后，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從功能學(xué)角度鑒定了誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞，說(shuō)明該細(xì)胞具有內(nèi)皮功能。

參考文獻(xiàn)

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