李亞雄　仇正興

摘 要：本研究參照美國國家環(huán)境保護局（EPA）關于消毒劑在干燥的非生物表面的抗病毒效果測評方法，評定了美國陶氏化學公司的格利特消毒劑GLUTEX GS2對犬細小病毒的殺毒效力。結果表明：經(jīng)合成硬水1：256倍稀釋的格利特消毒劑GLUTEX GS2，在與干燥處理的犬細小病毒膜充分接觸10 min后，病毒活性低于2.5個滴度，表明此消毒劑對犬細小病毒具有殺滅效力，可用于此病毒的日常消毒中。

關鍵詞：犬細小病毒；抗病毒效果；評測；GLUTEX GS2消毒劑

1 實驗目的

本測試旨在測評陶氏化學公司生產的格利特消毒劑GLUTEX GS2的殺病毒效力。其方法是，該產品先按要求進行稀釋，隨后用稀釋液處理受病毒污染的物體表面，然后從處理物體表面回收病毒，通過評估回收病毒的傳染力確定消毒劑的消毒效率。

2 實驗材料和方法

2.1 測試病毒

試驗所用犬細小病毒（CPV MLV）由美國康奈爾大學M. J. Appel博士提供。該病毒懸浮液是組織培養(yǎng)基。

2.2 細胞組織培養(yǎng)液和培養(yǎng)基

本研究所用犬腫瘤細胞來自位于美國馬里蘭州羅克維爾的美國標準菌庫（American Type Culture Collection，ATCC）。細胞培養(yǎng)物在添加了10 %（V/V）牛胎兒血清（在56 ℃ 熱滅活30 min）、100 單位/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、50 μg/mL慶大霉素、 2.5 μg/mL兩性毒素B和25 mM四羥乙基哌嗪乙磺酸的最低必需培養(yǎng)基（Minimal Essential Medium，MEM）中進行常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)后置于37 ℃含5 %CO2的潮濕空氣下的一次性實驗室器皿中，制成單層組織培養(yǎng)物。感染病毒后，培養(yǎng)物置于裝有相同成分并添加了50 ng/mL（Calbiochem）表皮生長因子。

2.3 試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）采用Dulbecco和Vogt的方法配制（實驗醫(yī)學雜志[J]. 1954， Vol.99：167-182）。合成硬水在使用當天配制，配制方法參照 AOAC 4.024法{美國[美國公職分析化學工作者協(xié)會（AOAC）]，第14版，1984，第70～71頁}。

2.4 消毒劑的制備

每份消毒劑在使用當天按照1∶256的比例用1 247 mg/kg AOAC合成硬水進行稀釋。

2.5 病毒膜的制備

病毒膜通過將0.2 mL的病毒懸浮液涂復在滅菌的皮氏玻璃培養(yǎng)皿底部制作而成。隨后置于室溫（約23 ℃）及環(huán)境濕度下，避免直接光照直至明顯干燥（約45～75 min）。

2.6 用消毒劑處理病毒薄膜

干燥的病毒薄膜在約23 ℃下用2.0 mL消毒劑稀釋液（噴霧）處理，使兩者保持10 min的充分接觸。在接觸一定時間后，用橡膠淀帚刮下培養(yǎng)皿底部物質，并立即取一小份病毒-消毒劑混合物加入交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）凝膠過濾柱中，用凝膠過濾法將病毒從消毒劑中分離出。

2.7 病毒對照薄膜的處理

在用消毒劑處理一份病毒薄膜時，另一份相同病毒薄膜用2 mL磷酸鹽緩沖生理鹽水再次懸浮，隨后取一小份混合液加入交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）過濾柱中。

2.8 交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾（Sephadex Gel Filtration）

交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾按照Blackwell和Chen的改良方法[美國公職分析化學工作者協(xié)會雜志53期（1970年）第1229～1236頁]進行操作。3 cc交聯(lián)葡聚糖柱（LH-60-120）利用磷酸鹽緩沖生理鹽水保持平衡，離心清除液體中的空隙體積，隨后裝入約0.6 mL病毒-消毒劑混合液或病毒-磷酸鹽緩沖對照混合液，并再次離心。

2.9 病毒回收分析

對每份病毒-消毒劑和對照病毒濾出液進行稀釋，接種至細胞培養(yǎng)液中。每份稀釋液至少使用4份培養(yǎng)液。接種0.05 mL單層細胞，并在37 ℃下培養(yǎng)1 h。干燥后，加入維持培養(yǎng)基（0.2 mL），并在恒溫37 ℃下接種培養(yǎng)液。接種7 d后，記錄培養(yǎng)液細胞病變效應。細胞病變效應最終結果見表1。

2.10細胞毒性對照

每份已稀釋消毒劑通過交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾，利用磷酸鹽緩沖液進行倍比稀釋，隨后接種于添加病毒消毒劑混合液的細胞培養(yǎng)液中。接種后7 d后，記錄細胞培養(yǎng)液的細胞毒性。

2.11 計算方法

采用Reed-Muench法（L. J. Reed和H. Muench. 美國衛(wèi)生醫(yī)學雜志[J].1938，Vol.27：493-497），計算以50 %侵染性的log10（TCID50）和毒性（TD50），以表示病毒效價及細胞毒性。

3 實驗結果

格利特消毒劑GLUTEX GS2對犬細小病毒的病毒感染性和細胞毒性測定結果見表1。

4 實驗結論

陶氏化學公司格利特消毒劑GLUTEX GS2在測試條件下，能有效殺滅犬細小病毒?！酢?/p>