陳淑華，庫(kù)旭鋼，閆貴偉，丁振江，何啟蓋＊

（1.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070）

豬A群輪狀病毒VP6的表達(dá)及IgG抗體ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

陳淑華1，2，庫(kù)旭鋼1，2，閆貴偉1，2，丁振江1，2，何啟蓋1，2＊

（1.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070）

為建立豬A群輪狀病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法，用于開展對(duì)該病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查和免疫抗體評(píng)估，進(jìn)行了豬A群輪狀病毒TM-a株內(nèi)衣殼VP6基因的表達(dá)，用SDS-PAGE和Western blot鑒定分析。目的蛋白得到表達(dá)，大小約70ku，Western blot表明，該蛋白與豬A群輪狀病毒陽(yáng)性血清反應(yīng)。用該蛋白作為包被抗原，通過(guò)對(duì)條件優(yōu)化，包被抗原濃度為2μg／mL，待檢血清稀釋倍數(shù)為1∶40倍，標(biāo)記抗體的稀釋倍數(shù)為1∶4 000倍，建立了檢測(cè)豬輪狀病毒血清IgG抗體的間接ELISA方法。用該方法檢測(cè)臨床樣品142份，并與間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）對(duì)比，結(jié)果顯示，兩者陽(yáng)性符合率為94.6%，陰性符合率為83.4%，總符合率為91.5%，表明該方法有效可行。用建立的方法檢測(cè)臨床上不同年齡階段的豬血清639份，分析其臨床感染情況。結(jié)果證明該方法可用于豬輪狀病毒流行病學(xué)調(diào)查、豬群抗體水平評(píng)估。

豬輪狀病毒；內(nèi)衣殼蛋白；間接ELISA

輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬呼腸病毒科輪狀病毒屬，是引起嬰幼兒和幼齡動(dòng)物腹瀉的一種病原［1］，感染豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PoRV）的仔豬以厭食、嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床特征，嚴(yán)重的排水樣糞便，導(dǎo)致仔豬死亡［2］。在全國(guó)發(fā)生大規(guī)模的仔豬病毒性腹瀉，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，豬輪狀病毒也是引起仔豬腹瀉的重要病原之一［3］。

輪狀病毒基因組由11個(gè)dsRNA片段組成，分別編碼病毒6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP），結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定［4］。VP6蛋白是重要的群抗原，屬于內(nèi)層衣殼蛋白，占病毒蛋白總量的51%，能夠產(chǎn)生特異性抗原決定簇，而且在病毒的復(fù)制和裝配過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［5－8］。RV根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)和抗原性分為A～G等7個(gè)組。A組、B組和C組可引起人類和動(dòng)物感染，而D組、E組、F組和G組主要引起動(dòng)物感染。其中A組RV在人類和動(dòng)物中感染最為普遍［9］。因此，本研究利用豬A群輪狀病毒的群抗原VP6蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)豬A群輪狀病毒抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，為豬A群輪狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、細(xì)胞、血清 豬A群輪狀病毒TM-a株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存；細(xì)胞MA-104由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供；豬輪狀病毒（PoRV）陽(yáng)性血清、豬輪狀病毒（PoRV）陰性血清、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）陽(yáng)性血清、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）陽(yáng)性血清、豬瘟病毒（CSFV）陽(yáng)性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）陽(yáng)性血清、豬偽狂犬病病毒（PRV）陽(yáng)性血清，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存或制備。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；載體pGEX-KG，由本實(shí)驗(yàn)室保存；脫脂奶粉為BD公司產(chǎn)品；BSA為AMRESCO公司產(chǎn)品；Tween-20為Sigma公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為AbDSerotec公司產(chǎn)品；TMB底物顯色液為3，3，5，5、四甲基聯(lián)苯氨、6孔酶標(biāo)板為Costar公司產(chǎn)品；Theromo-MK 3型酶標(biāo)儀為賽默飛世爾（上海）有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑為分析純。

1.1.3 菌株 大腸埃希菌JM105菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 豬輪狀病毒陽(yáng)性和陰性血清的制備 選用45日齡的保育豬6頭，分成2組，每組各3頭，1組攻毒、1組對(duì)照。毒株為豬A群輪狀病毒TM-a株，此毒株病毒滴度為108.5TCID50／mL。用該毒株攻毒，45日齡首次攻毒，攻毒劑量為5mL每頭；75日齡先采血再攻毒，攻毒劑量為5mL每頭，105日齡采血。對(duì)照不攻毒，同樣時(shí)間段采血，其血清為陰性血清。

1.2.2 檢測(cè)豬輪狀病毒的間接免疫熒光試驗(yàn) 間接免疫熒光試驗(yàn)操作步驟：取長(zhǎng)滿的MA-104細(xì)胞1瓶，將細(xì)胞吹散，細(xì)胞懸液200μL／孔加入96孔細(xì)胞板中，在體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱于37℃培養(yǎng)；待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，接毒（豬A群輪狀病毒TM-a株）100μL／孔，37℃培養(yǎng)1h后，再加入MEM細(xì)胞維持液100μL／孔，同時(shí)設(shè)不接毒的空白對(duì)照組；在細(xì)胞發(fā)生病變之前，棄去96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的 MEM 維持液，用PBS洗滌，200μL／孔，每次3min，洗滌5次，拍干；加入－20℃冷丙酮，100μL／孔，放入－20℃冰箱，固定30min；用PBS洗滌，200μL／孔，每次3min，洗滌5次，拍干，將96孔板自然晾干；加入1∶40倍稀釋的陽(yáng)性和陰性血清各100μL，37 ℃培養(yǎng)30min；用 PBS洗滌，200μL／孔，每次3min，洗滌5次，拍干，加入1∶60倍稀釋的羊抗豬FITC標(biāo)記的熒光二抗50μL，37℃培養(yǎng)30min；用PBS洗滌，200μL，每次3min，洗滌5次，拍干；在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 重組菌的構(gòu)建 將PoRV TM-a株接種MA-104細(xì)胞，待出現(xiàn)病變后，反復(fù)凍融細(xì)胞3次，離心取上清液，用于提取病毒總 RNA［10］，RT-PCR擴(kuò)增輪狀病毒的VP6全基因，構(gòu)建重組菌。引物為VP6F：CCGAATTCATGGAGGTTCTGTACTCATT，VP6R：CCCGTCGACTCACTTAATCAA-CATGCTTC，其中VP6F帶有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，VP6R帶有SalⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線為相應(yīng)酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增條件為：94℃5min；94℃50min，56℃1min，72 ℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10min，4 ℃5min?；厥誔CR產(chǎn)物，將PCR回收產(chǎn)物和pGEXKG載體分別用EcoRⅠ＋SalⅠ雙酶切后連接轉(zhuǎn)化于大腸埃希菌JM105感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后用于VP6蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.4 VP6蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 重組菌接種于LB液體培養(yǎng)基復(fù)蘇，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，按1∶100接種于含有10μg／mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，放37℃搖床中培養(yǎng)至OD 630nm值約為0.5時(shí)，加IPTG至終濃度為1mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)6h，每隔1h取1.5mL菌液進(jìn)行SDS-PAGE制樣。將菌液于4℃、8 000r／min離心5min，沉淀用50μL滅菌水重懸，煮沸10min，冰浴10min后，于4℃、8000r／min離心5min，取上清與等量2XLoading buffer混勻后水浴煮沸10min，用于SDS-PAGE電泳分析。

重組菌經(jīng)放大體系IPTG誘導(dǎo)后，在蛋白最大表達(dá)量時(shí)收集菌液，用buffer A重懸，反復(fù)凍融3次，超聲波破碎后于4℃、12 000r／min離心10min，沉淀用SDS-PAGE檢測(cè)，將提取的包涵體用含GST標(biāo)簽的層析柱純化。純化后進(jìn)行 Western blot鑒定。蛋白濃度用蛋白儀器測(cè)定。

1.2.5 間接ELISA方法的建立

1.2.5.1 蛋白包被濃度及血清稀釋倍數(shù)的確定利用方陣滴定原理［11］，將蛋白依次稀釋成10、8、6、4、2、1、0.5、0.25μg／mL，陽(yáng)性和陰性血清依次稀釋成1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640，計(jì)算對(duì)應(yīng)的P／N值，P／N值最大的為蛋白包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。

1.2.5.2 包被條件的確定 以確定的最佳蛋白包被濃度進(jìn)行包被，分別于37℃孵育1h后4℃過(guò)夜，37℃孵育2h，依次封閉、一抗反應(yīng)、二抗反應(yīng)、顯色、終止反應(yīng)，用測(cè)得的OD 630nm值計(jì)算P／N值，P／N值最大的為包被條件。

1.2.5.3 封閉液和封閉時(shí)間的確定 以確定的最佳蛋白包被濃度、包被條件進(jìn)行包被，用5種不同封閉液（5g／L BSA，50g／L脫脂奶粉，4g／L的明膠，20g／L的海藻糖，20g／L的PEG8000）依次進(jìn)行封閉、一抗反應(yīng)、二抗反應(yīng)、顯色、終止反應(yīng)，用測(cè)得的OD 630nm值計(jì)算P／N值，以P／N值最大的組確定封閉液。將選擇的封閉液分別在37℃封閉1、1.5、2、2.5、3h，隨后一抗反應(yīng)、二抗反應(yīng)、顯色、終止反應(yīng)，用測(cè)得的OD 630nm值計(jì)算P／N值，以P／N值最大的組確定封閉時(shí)間。

1.2.5.4 待檢血清反應(yīng)時(shí)間的確定 在已優(yōu)化反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，按反應(yīng)時(shí)間分成5組，分別為37℃孵育30、45、60、90、120min，經(jīng)洗滌、顯示、終止反應(yīng)，用測(cè)得的OD值630nm計(jì)算P／N值，以P／N值最大的組確定一抗即待檢血清反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5.5 標(biāo)記抗體工作濃度和反應(yīng)時(shí)間的確定在已優(yōu)化反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，根據(jù)二抗使用說(shuō)明書，按二抗?jié)舛炔煌殖?組，分別為1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶7 000、1∶8 000。經(jīng)洗滌、顯色、終止反應(yīng)，用測(cè)得的OD 630nm值計(jì)算P／N值，以P／N值最大的組確定二抗工作濃度。已優(yōu)化反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，將二抗分別在37℃孵育15、30、45、60min這4個(gè)不同時(shí)間段反應(yīng)。經(jīng)洗滌、顯色、終止反應(yīng)，用測(cè)得的OD 630nm值計(jì)算P／N值，以P／N值最大的組確定二抗工作時(shí)間。

1.2.5.6 底物反應(yīng)時(shí)間的確定 在已經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，按底物的作用時(shí)間分成4組，37℃作用5、10、15、20min，終止反應(yīng)，用測(cè)得的OD 630nm值計(jì)算P／N值，以P／N值最大的組確定底物反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5.7 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 選擇20份經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)確定為陰性的血清，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，當(dāng)樣本OD 630nm值≥X＋3SD時(shí)，可以在99.9%的水平上判定為抗體陽(yáng)性，當(dāng)樣品OD 630nm值＜X＋3SD時(shí)，可以在99.9%的水平上判定為抗體陰性。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 在相同的條件下對(duì)PEDV，TGEV、CSFV、PRV、PRRSV陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)PoRV的陽(yáng)性和陰性對(duì)照和空白孔對(duì)照，評(píng)價(jià)ELISA 的特異性［12］。

1.2.7 敏感性試驗(yàn) 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 084 倍 稀 釋［13］，分 別 用 建 立 的ELISA方法和間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，評(píng)價(jià)ELISA的敏感性。

1.2.8 與間接免疫熒光試驗(yàn)方法的比較 隨機(jī)抽取142份血清，分別用建立的ELISA方法和間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1.2.9 臨床初步應(yīng)用檢測(cè) 用建立的ELISA方法對(duì)來(lái)自湖北、河北、江西、四川、福建等省份的臨床樣品639份進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 獲得豬輪狀病毒陽(yáng)性和陰性血清

制備的豬輪狀病毒陽(yáng)性血清（第2次采血的血清）用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)，出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，獲得豬輪狀病毒陽(yáng)性血清（圖1）；制備的豬輪狀病毒陰性血清（第2次采血）用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)，無(wú)陽(yáng)性信號(hào)，獲得豬輪狀病毒陰性血清（圖2）。

圖1 豬輪狀病毒陽(yáng)性血清間接免疫熒光試驗(yàn)Fig.1 Results of porcine rotavirus positive serum detected by IFA

圖2 豬輪狀病毒陰性血清間接免疫熒光試驗(yàn)Fig.2 Results of porcine rotavirus negative serum detected by IFA

2.2 VP6基因的擴(kuò)增

反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增豬輪狀病毒TM-a株VP6基因結(jié)果見圖3。

2.3 重組質(zhì)粒pGEX-KG-VP6的雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ＋SalⅠ雙酶切得到2條大小分別為1 194bp和5 006bp的片段，分別為插入的VP6基因和載體質(zhì)粒（圖4）。

2.4 SDS-PAGE分析

試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在約70ku處出現(xiàn)特異性蛋白條帶。經(jīng)不同時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)4h時(shí)蛋白表達(dá)量最大，對(duì)照質(zhì)粒在相應(yīng)的條帶處無(wú)表達(dá)（圖5）。

圖3 VP6基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of VP6gene products amplified by PCR

圖4 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-VP6的酶切鑒定Fig.4 Enzyme digestion identification of pGEX-KG-VP6

圖5 重組菌pGEX-KG-VP6不同時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the expressed proteins from the induced pGEX-KG-VP6 in different time

2.5 Western blot分析

重組菌經(jīng)破碎儀破碎后，沉淀包涵體用GST純化柱純化，經(jīng)Western blot分析，結(jié)果顯示，目的條帶初步得到純化（圖6）。并表明該蛋白具有生物學(xué)活性，可作為抗原用于本研究的ELISA方法建立。

圖6 目的蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of the expressed proteins

2.6 間接ELISA方法的建立

利用方陣滴定原理及各項(xiàng)試驗(yàn)條件的優(yōu)化，最終確定間接ELISA方法的工作流程如下：以pH 9.6磷酸鹽作為包被緩沖液，VP6蛋白包被量為2μg／mL，每孔100μL，37℃孵育1h后4℃包被過(guò)夜；200μL的PBST洗滌5次，每次3min，最后1次拍干，每孔加200μL的50g／L脫脂奶粉于37℃封閉2h；200μL的PBST洗滌5次，每次3min，最后1次拍干，每孔加1∶40稀釋的待檢血清100μL，37℃孵育1h；200μL的PBST洗滌5次，每次3min，最后1次拍干，每孔加羊抗豬酶標(biāo)二抗100μL，37 ℃孵育30min；200μL的 PBST 洗滌5次，每次3min，最后1次拍干，依次加入底物A、底物B，各50μL，避光反應(yīng)10min，最后加終止液50μL，10min內(nèi)用波長(zhǎng)為630nm測(cè)每孔光吸收值。

間接免疫熒光鑒定的20份陰性血清，用建立的ELISA方法測(cè)定OD 630nm值，經(jīng)檢測(cè)，這20份陰性血清OD 630nm值的平均值為0.267，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.049，所以，當(dāng) OD 630nm 值≥0.267＋3×0.049即OD 630nm值≥0.414時(shí)為陽(yáng)性，OD 630nm值＜0.414時(shí)為陰性。

2.7 特異性試驗(yàn)

對(duì)PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV、PRV、PoRV這6種病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，與PoRV的陽(yáng)性血清相比，其他5種陽(yáng)性血清差異顯著，低于陽(yáng)性判定值，說(shuō)明建立的間接ELISA檢測(cè)方法特異性良好，無(wú)交叉反應(yīng)（圖7）。

圖7 不同病毒抗體間交叉反應(yīng)結(jié)果Fig.7 The ELISA results of cross reaction with antibodies against other viruses

2.8 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行4、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 084倍稀釋，分別用建立的ELISA方法和間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)。用建立的ELISA方法檢測(cè)，當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋256倍時(shí)，OD 630nm值為0.563；而用間接免疫熒光檢測(cè)，當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋128倍時(shí)，無(wú)陽(yáng)性信號(hào)。因此，建立的間接ELISA方法比間接免疫熒光試驗(yàn)的敏感高。

2.9 樣品檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)142份樣品進(jìn)行符合率對(duì)比，建立的間接ELISA方法檢測(cè)為陰性37份，陽(yáng)性105份；間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)為陰性31份，陽(yáng)性111份。以間接免疫熒光試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，陰性符合率為83.4%，陽(yáng)性符合率為94.6%，總符合率為91.5%。然而檢測(cè)來(lái)自湖北、河北、江西、四川、福建等省份的臨床樣品639份，用于初步的流行病學(xué)調(diào)查，其中仔豬樣品117份，陰性43份，陽(yáng)性74份，仔豬感染率為63.2%；保育豬樣品65份，陰性13份，陽(yáng)性52份，保育豬感染率為65.0%；育肥豬樣品228份，陰性24份，陽(yáng)性204份，育肥豬感染率為89.5%；母豬樣品229份，陰性8份，陽(yáng)性221份，感染率為96.5%；總感染率為86.2%。各年齡段豬的感染率見圖8。

圖8 各年齡階段豬的豬輪狀病毒感染率Fig.8 The porcine rotavirus infection rates in each age stage pigs

3 討論

輪狀病毒屬于人畜共患病病原，據(jù)相關(guān)報(bào)道，全世界每年有527 000兒童死于A群輪狀病毒感染［14］。2010年冬季以來(lái)，我國(guó)發(fā)生仔豬病毒性腹瀉，也給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

VP6蛋白以三聚體形式構(gòu)成RV的內(nèi)衣殼層，與外殼蛋白VP7、VP4及核心蛋白VP2相互作用，在維持RV的整體結(jié)構(gòu)中扮演重要角色［15］。同時(shí)，VP6蛋白也是輪狀病毒重要的群特異性抗原。因此，VP6蛋白是輪狀病毒感染血清抗體檢測(cè)的重要候選抗原［16］。本研究構(gòu)建豬輪狀病毒VP6重組蛋白的表達(dá)載體pGEX-KG-VP6，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE和Western blot鑒定分析，重組蛋白獲得表達(dá)，有生物學(xué)活性，可作為本試驗(yàn)建立的ELISA檢測(cè)方法的包被抗原。其中Western blot鑒定中，發(fā)現(xiàn)還有一條與目的條帶相近，大小約65ku條帶，經(jīng)分析，推測(cè)是由于70ku包涵體蛋白的降解產(chǎn)物，同樣有抗原性［17］。

ELISA技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在各實(shí)驗(yàn)室及基層單位已普遍應(yīng)用［18］。本研究利用建立的間接ELISA方法檢測(cè)臨床上未免疫豬輪狀病毒疫苗的血清639份，分析臨床上豬輪狀病毒自然感染率，其中，仔豬感染率為63.2%，保育豬感染率為65.0%，育肥豬感染率為89.5%，育肥豬感染率為89.5%，總感染率86.2%。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，隨著豬日齡的增長(zhǎng)，輪狀病毒的感染也隨之增加。該研究結(jié)果為豬輪狀病毒的防控提供了技術(shù)支持和第一手基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Expression of VP6 and Development of An ELISA for Detection of IgG Antibodies against Porcine Rotavirus Group A

CHEN Shu-hua1，2，KU Xu-gang1，2，YAN Gui-wei1，2，DING Zhen-jiang1，2，HE Qi-gai1，2

（1.StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology，Wuhan，Hubei，430070，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan，Hubei，430070，China）

The aim of this research was to establish an indirect ELISA method for clinically detection of antibodies against porcine rotavirus Group A （PoRV）in pigs.VP6protein of Group A PoRV TM-a strain was successfully expressedinvitro.This recombinant protein was confirmed through SDS-PAGE and Western blot.The size of recombinant protein was 70ku and can be recognized by positive serum against PoRV.After optimization，2μg／mL of the protein was used to coat the plate，the dilution of clinical serum and HRP-conjugated antibody were 1∶40and 1∶4 000，respectively.The indirect ELASA detection method was established and used to detect clinical samples.Totally，142clinical samples were detected as positive according to our method and confirmed through indirect immunofluorescence assay（IFA）.The agreement of negative and positive were 83.4%，94.6%，resulting the general agreement of 91.5%between ELISA and IFA.This ELISA was further used to detect 638serum samples collected from different ages of swine to analyse the infection rate of PoRV in swine farm.The developed ELISA could be a convenient and accurate method for the epidemiological investigation of PoRV infection in pigs.

Porcine rotavirus；inner capsid protein VP6；indirect ELISA

S852.659.4；Q789

A

1007-5038（2014）07-0001-06

2014-01-10

國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）

陳淑華（1987－），女，福建漳州人，獸醫(yī)碩士，主要從事豬傳染病防控研究。＊ 通訊作者