陳 兵，胡運發(fā)，孫 潔，陳書琨，劉建利，曾少靈，曹琛福，張彩虹，阮周曦，林慶燕，呂建強，楊俊興，花群義，盧體康，秦智鋒＊

新城疫病毒實時熒光RTLAMP檢測方法的建立*

陳 兵1，胡運發(fā)1，孫 潔2，陳書琨1，劉建利2，曾少靈1，曹琛福2，張彩虹2，阮周曦2，林慶燕1，呂建強1，楊俊興1，花群義1，盧體康1，秦智鋒1＊

（1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳 518045；2.深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院，廣東深圳 518001）

新城疫是影響家禽養(yǎng)殖業(yè)的重大動物疫病，建立現(xiàn)場快速分子學(xué)檢測方法是其防控關(guān)鍵。借助熱裂解法抽提病毒RNA，在篩選出最佳核酸染料Calcein的基礎(chǔ)上，建立新城疫病毒（NDV）實時熒光反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（rRT-LAMP）檢測法，并對該法進行特異性、敏感性及準確性分析。試驗結(jié)果顯示，本試驗所建立的NDV-rRT-LAMP方法可有效鑒別NDV，其敏感性可檢測至50個基因拷貝，與國家標準實時熒光定量RT-PCR檢測法一致；該法特異性強，與AIV、IBV等常見禽呼吸道傳染病病原無交叉反應(yīng)。小規(guī)模田間試驗顯示，該法用于NDV的普查監(jiān)測，結(jié)果可靠。結(jié)果表明，建立的NDV-rRT-LAMP檢測法可滿足NDV現(xiàn)場快速分子檢測需求。

新城疫病毒；實時熒光反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增；現(xiàn)場檢測

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一類主要感染禽類的烈性傳染病，是我國重點防控的重大動物疫病［1］。發(fā)病率和病死率較高，是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病［16－18］。建立適合基層和現(xiàn)場使用的快速靈敏的分子生物學(xué)檢測方法，成為相關(guān)部門防控該病的重要技術(shù)支撐［1］。

LAMP自2000年發(fā)明以來，在各個核酸檢測領(lǐng)域進行了大量的使用［2－5］。本實驗室已初步建立了口蹄疫病毒RT-LAMP檢測方法［6］和H5亞型禽流感病毒實時熒光RT-LAMP檢測法［7］，并得到了一定的應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，建立了基于現(xiàn)場熱裂解抽提核酸的 NDV RT-LAMP（real-time RT-LAMP，rRT-LAMP）檢測法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準毒株 新城疫病毒標準強毒株F48E9（NDV-F48E9）、新城疫凝集抗原（NDV-HI）、新城疫Ⅰ系疫苗（Mukteswar株，NDV-Ⅰ））、新城疫Ⅳ系疫苗（La Sota株，NDV-Ⅳ）、H5亞型禽流感抗原（AIV-Re-6）、傳染性支氣管炎活疫苗（IBV-LDT3-A株）、傳染性法氏囊病活疫苗（IBDV-Gt株）等抗原，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.1.2 主要儀器與試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀，EZ1核酸抽提儀，ESEQuant Tube Scanner儀；RNase free H2O（TaKaRa），10× Bst polymerase buffer（New England Biolabs），large fragment Bst DNA polymerase（New England Biolabs），AMV（TaKaRa），25mmol／L MgSO4（TaKaRa），Betaine（Sigma），10mmol／L dNTPs（Sigma），500μmol／L MnCl2（Sigma），EZ1Viral RNA Mini Kit v2.0（Qiagen），qRT-PCR Kit（Applied Biosystems），Calcein（Fluka）。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 融合蛋白基因（F基因）是新城疫病毒的重要免疫原蛋白基因，對新城疫的診斷具有重要意義。本試驗根據(jù)GenBank中NDV F基因的核苷酸序列，使用DNA Star分析選出6個高特異性的保守核苷酸區(qū)域，通過Primer Premier 5設(shè)計外引物（F3和B3）、內(nèi)引物（FIP和BIP）等2對引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成，相應(yīng)序列見表1。用前將1mmol／L各引物貯存液按FIP／BIP∶F3／B3∶LPF／LBF為8∶1∶4混勻備用。

1.2.2 NDV核酸抽提及克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 用EZ1核酸抽提儀抽提 NDV-F48E9、NDV-HI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ各毒株 RNA，洗脫體積為90μL。采用NDV-rRT-LAMP外引物F3和B3分別作為上游和下游引物，以 NDV-F48E9RNA為模板進行RTPCR擴增。反應(yīng)程序為：50 ℃ 45min；95 ℃10min；94℃45s，56℃60s，72℃60s，共30個循環(huán)；72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。分離純化擴增產(chǎn)物，使用pMD18-T Vector構(gòu)建pMD18-T-F重組質(zhì)粒并測定濃度，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 NDV-rRT-LAMP檢測引物Table 1 Primers for NDV-rRT-LAMP

1.2.3 NDV-rRT-LAMP檢測方法 參考相關(guān)報道［6，7，14］，用 RNase free H2O 配 制 500 μmol／L MnCl2，25μmol／L Calcein儲存液，二者按2.5∶1混勻作為Calcein工作液。取 NDV-F48E9、NDVHI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ 病 毒 尿 囊 液 各 20μL，于100℃熱裂解2min，離心并取2μL作為模板。NDV-rRT-LAMP反應(yīng)體系為25μL，其中10×Bst DNA buffer 2.5μL，Bst DNA Polymerase 1μL，Amv 1μL，Mg2＋0.6μL，dNTPs 3.5μL，Betaine 5μL，Primers mix 1μL，Calcein-Mn2＋1μL，RNase free H2O 8.5μL。反應(yīng)體系混勻后瞬時離心，于ESEQuant Tube Scanner儀上63℃反應(yīng)50min。同時設(shè)置陰性對照（無病毒尿囊液）和空白對照（RNase free H2O）。

1.2.4 NDV-rRT-LAMP可視化檢測方法 重新進行1.2.3中的 NDV-rRT-LAMP反應(yīng)。在制備反應(yīng)液時，取0.5μL SYBR GreenⅠ作為染色劑，于反應(yīng)前小心滴加于反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè)，小心操作避免掉入反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束后顛倒反應(yīng)管以混入染料，觀察顏色變化。將反應(yīng)液置于紫外燈下，觀察顏色變化。

1.2.5 NDV-rRT-LAMP檢測法的評價

1.2.5.1 NDV-rRT-LAMP敏感性試驗 將 NDVHI抗原原液10倍系列稀釋，熱裂解法抽提核酸后同時進行 NDV-rRT-LAMP 和實時熒光 RT-PCR（real-time RT-PCR，rRT-PCR），對比2種檢測方法的敏感性。將pMD○R18-T-H5從105拷貝開始進行10倍倍比稀釋并進行NDV-rRT-LAMP，確定該法可檢測的最低基因拷貝數(shù)。

1.2.5.2 NDV-rRT-LAMP特異性試驗 取 NDVHI、AIV-Re-6、IBV-LDT3-A、IBDV-Gt等病毒經(jīng)核酸抽提儀抽提核酸，同時進行NDV-rRT-LAMP檢測和可視化檢測，評價該方法的特異性。

1.2.5.3 NDV-rRT-LAMP田間樣品檢測 隨機采取雞喉頭／泄殖腔棉拭子浸出液20份，熱裂解法抽提核酸并進行 NDV-rRT-LAMP；同時采用EZ1抽提RNA，參照新城疫實時熒光RT-PCR檢測試劑盒進行，探討該方法的田間實用性及可靠性。

2 結(jié)果

2.1 NDV-rRT-LAMP實時熒光檢測結(jié)果

以 NDV-F48E9、NDV-HI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ直接熱裂解模板為核酸，于儀器上進行實時檢測。4個新城疫毒株檢測結(jié)果均為陽性，出現(xiàn)實時擴增曲線；陰性尿囊液（NTC）和空白水對照（BTC）的檢測結(jié)果為陰性，檢測結(jié)果與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 熱裂解法NDV-rRT-LAMP實時熒光檢測結(jié)果Fig.1 The results of NDV-rRT-LAMP with thermal cracking

2.2 NDV-rRT-LAMP可視化檢測結(jié)果

各毒株在儀器上實時熒光RT-LAMP檢測結(jié)束后，取出肉眼觀察，各反應(yīng)管液比較清晰，很少觀察到混濁沉淀。將反應(yīng)液倒置，反應(yīng)前將SYBR GreenⅠ預(yù)滴加于管蓋內(nèi)側(cè)的0.5μL SYBR GreenⅠ混入反應(yīng)液，觀察發(fā)現(xiàn) NDV-F48E9、NDV-HI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ等實時熒光陽性的反應(yīng)液呈現(xiàn)黃綠色，紫外光下為翠綠色；陰性尿囊液和空白水對照等實時熒光陰性反應(yīng)液呈現(xiàn)為淡橙色，紫外光下為淡綠色（圖2）。

圖2 熱裂解法NDV-rRT-LAMP肉眼檢測結(jié)果Fig.2 The results of NDV-rRT-LAMP with thermal cracking observed with naked eyes

2.3 NDV-rRT-LAMP檢測方法的評價結(jié)果

2.3.1 NDV-rRT-LAMP 敏感性試驗結(jié)果 將NDV-HI 10倍系列稀釋，熱裂解法抽提核酸后直接進行 NDV-rRT-LAMP 和 rRT-PCR 檢測。結(jié)果NDV-rRT-LAMP最低檢測限為10－5稀釋度，與新城疫rRT-PCR檢測靈敏度相當（圖3）。將pMD○R18-T-F重組質(zhì)粒從105μL開始進行10倍稀釋，進行NDV-rRT-LAMP檢測，結(jié)果顯示該法最低檢測限在101～102，計算約為50個基因拷貝。

圖3 熱裂解法NDV-rRT-LAMP靈敏度試驗結(jié)果Fig.3 Sensitivity test results of NDV-rRT-LAMP with thermal cracking

2.3.2 NDV-rRT-LAMP特異性試驗結(jié)果 NDV-rRT-LAMP特異性試驗表明，所建立的方法無論進行實時熒光RT-LAMP檢測，還是加入染料后進行肉眼觀察，均與 AIV-Re-6、IBV-LDT3-A、IBDV-Gt等病原體無交叉反應(yīng)，表明所建立的方法特異性強。

2.4 田間樣品檢測結(jié)果

20份田間樣品同時進行NDV-rRT-LAMP和實時熒光RT-PCR檢測，結(jié)果顯示兩種檢方法均特異性檢測出NDV陽性4份，陰性16份，檢測結(jié)果完全一致。

3 討論

LAMP方法自2001年發(fā)明以來，引發(fā)了廣大科研人員的關(guān)注，有關(guān)LAMP檢測技術(shù)的應(yīng)用也十分廣泛［2－14］。LAMP在非洲受到了廣泛關(guān)注，被制定成標準方法用于人的非洲錐蟲病的診斷。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）也對禽流感病毒RT-LAMP技術(shù)進行了評價，認為該方法簡便實用，同時也指出該法存在漏檢現(xiàn)象。

在LAMP的引物設(shè)計中，目前多采用設(shè)計環(huán)引物來提升檢測速度。在本研究中，如果再加入2個環(huán)引物，則需要找到8個相對保守的區(qū)域，非常困難。所以在找到6個相對保守的區(qū)域情況下，沒有設(shè)計環(huán)引物而直接進行檢測。發(fā)現(xiàn)盡管不采用環(huán)引物，仍然在1h內(nèi)可以得到檢測結(jié)果，檢測速度仍然快于實時熒光定量RT-PCR技術(shù)。

LAMP傳統(tǒng)結(jié)果判定方法有兩種，一種是通過在終反應(yīng)液中加入核酸染料，觀察熒光及顏色變化并結(jié)合凝膠電泳判斷檢測結(jié)果；另一種是通過實時監(jiān)控反應(yīng)液中白色焦磷酸鎂濁度而進行實時檢測。但采用一種小型便攜式儀器，將實時與肉眼觀察結(jié)合起來，以便在現(xiàn)場或基層進行快速分子生物學(xué)檢測，是LAMP進一步推廣使用的制約條件。我們通過反應(yīng)前在RT-LAMP反應(yīng)體系中加入熒光染色劑Calcein，在管蓋內(nèi)側(cè)滴加SYBR GreenⅠ，使用ESEQuant Tube Scanner儀進行實時擴增曲線，反應(yīng)后倒置混勻進行肉眼觀察，實現(xiàn)了實時熒光和肉眼觀察的同時檢測。由于SYBR GreenⅠ具有核酸擴增的抑制性，所以在反應(yīng)前不能將其混入反應(yīng)液，而需要滴加于管蓋內(nèi)側(cè)靠邊的位置。LAMP由于擴增效率極高，打開蓋后會出現(xiàn)氣溶膠污染，所以反應(yīng)結(jié)束后嚴禁打開管蓋。我們曾嘗試在實時熒光RTLAMP檢測前，在反應(yīng)液表面滴加石蠟油來防止打開蓋時的氣溶膠污染。但發(fā)現(xiàn)石蠟油對ESEQuant Tube Scanner儀的實時檢測有影響，熒光信號非常低，且不穩(wěn)定。

本試驗針對NDV的F基因中高保守且特異性強核苷酸序列設(shè)計引物，通過采用簡并引物來避免漏檢，可用于NDV基層的分子生物學(xué)快速檢測。同時本試驗成功將熱裂解法［15］與 NDV-rRT-LAMP結(jié)合，大幅度縮短了待檢樣品處理時間。

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Establishment of Real-time Fluorescent Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification for Newcastle Disease Virus Detection

CHEN Bing1，HU Yun-fa1，SUN Jie2，CHEN Shu-kun2，LIU Jian-li2，ZENG Shao-ling2，CAO Chen-fu2，ZHANG Cai-hong2，RUAN Zhou-xi2，LIN Qing－yan1，LüJian-qiang2，YANG Jun-xing2，HUA Qun-yi2，LU Ti-kang1，QIN Zhi-feng1

（1.ShenzhenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Shenzhen，Guangdong，518045，China；2.ShenzhenInspectionandQuarantineScienceResearchInstitute，Shenzhen，Guangdong，518001，China）

Newcastle disease virus（NDV）is a major causative agent and a rapid and sensitive molecular biological diagnosis is crucial to prevent and control Newcastle disease.NDV real-time fluorescent reverse transcription loop-mediated isothermal amplification（NDV-rRT-LAMP）was established by means of heat treatment of the samples.The sensitivity，specificity and repeatability of this method were evaluated.The results showed the sensitivity of this method was equal to the NDV real-time RT-PCR assay，and the detection limit was fifty gene copy per reaction.This method had no cross-reactivity with other avian disease agents such as AIV，IBV et al.Small-scale tests for field samples indicated this method was reliable for survey monitoring of N5on site.

Newcastle disease virus；real-time fluorescent reverse transcription loop-mediated isothermal amplification；detection on site

S852.659.5；Q789

A

1007-5038（2014）07-0011-04

2013-12-17

科技部質(zhì)檢公益項目（201210018-4）；深圳市基礎(chǔ)研究重點項目（JC201105190875A）

陳 兵（1981－），男，河南人，碩士研究生，主要從事進出境動物檢疫研究。＊通訊作者