同濟大學附屬同濟醫(yī)院檢驗科，上海 200065

香煙煙霧激活肺癌細胞Wnt/β-catenin信號途徑的機制研究

李冬 萬海英 姚懿雯 吳軍錄 權文強 周宏 張宇

同濟大學附屬同濟醫(yī)院檢驗科，上海 200065

背景與目的：香煙煙霧誘導的炎性反應可顯著促進肺腫瘤的生長，本研究通過體內外實驗明確香煙煙霧激活肺癌細胞Wnt/β-catenin信號途徑的機制。方法：利用尾靜脈注射鼠Lewis肺癌細胞方法建立小鼠肺癌模型，然后采用香煙煙霧對其進行刺激，誘發(fā)炎性反應。免疫組化方法檢測小鼠和人肺腫瘤組織中CD68、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和無磷酸化β-catenin的表達。采用Transwell?插入式細胞培養(yǎng)皿共培養(yǎng)人巨噬細胞和人肺癌細胞株A549細胞。采用蛋白質印跡法(Western blot)檢測A549細胞中無磷酸化β-catenin的表達及磷酸化的GSK-3β和Akt蛋白的表達。結果：免疫組化結果顯示，香煙煙霧刺激肺腫瘤負荷小鼠后，其腫瘤組織中巨噬細胞CD68+、TNF-α和無磷酸化β-catenin的表達均明顯高于對照組。肺癌患者腫瘤組織中，CD68和TNF-α的陽性表達均明顯高于正常組織。肺腺癌和鱗癌的無磷酸化β-catenin的染色陽性率分別為68.9%和62.2%，其陽性率與患者吸煙與否及腫瘤分期有關，差異有統計學意義(P均＜0.05)，并且CD68+的細胞數在無磷酸化β-catenin染色陽性的標本中顯著升高(P＜0.01)。Western blot檢測結果顯示，不同濃度香煙抽提物(cigarette smoke extract，CSE)刺激共培養(yǎng)細胞后，A549細胞中無磷酸化β-catenin的表達隨著CSE濃度的增加而顯著上升。在加入TNF-α中和抗體后，A549細胞中無磷酸化β-catenin的表達被抑制。用TNF-α處理A549細胞后，磷酸化的GSK-3β和Akt蛋白在2 h后表達增加，4 h后無磷酸化β-catenin蛋白表達也開始上調。結論：香煙煙霧誘導肺腫瘤組織中巨噬細胞釋放炎性反應因子TNF-α，進而通過Akt/GSK-3β途徑激活腫瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路。

巨噬細胞；肺癌；腫瘤壞死因子α；Wnt/β-catenin信號通路

近年來，慢性感染和炎癥導致腫瘤的形成和發(fā)展已受到廣泛關注。臨床研究的結果顯示，巨噬細胞的數量與肺癌的預后關系緊密［1-2］。侵入腫瘤的巨噬細胞及其釋放的大量可溶性的炎癥介質如TNF-α、IL-6等促進了腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移［3］。我們前期的體內、外試驗研究結果顯示，香煙煙霧誘導的炎性反應不僅對人類肺癌細胞的生長具有明顯的促進作用，而且顯著地促進肺癌小鼠模型的腫瘤生長，增加了小鼠肺腫瘤的數目，縮短了腫瘤負荷小鼠的生存期［4］。然而，迄今為止，有關炎性反應促進腫瘤發(fā)展的分子機制尚未完全闡明。

Wnt家族是由19個富含半胱氨酸的糖蛋白組成的蛋白家族，它們不僅在胚胎發(fā)育和維持機體的自穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用，而且在細胞的增殖、分化、運動以及抗凋亡過程中也起著重要作用［5］。Wnt/β-catenin信號通路是Wnt家族信號網絡的經典途徑，前期研究結果顯示，異常激活的Wnt/β-catenin信號通路由于受其調控的相關基因和蛋白水平的改變，導致細胞無限制增殖、生長，從而促使腫瘤發(fā)生［6］。

本研究擬從香煙煙霧與肺腫瘤細胞Wnt/ β-catenin信號的關系入手，進一步揭示香煙煙霧誘導的炎性反應發(fā)揮腫瘤促進作用的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本

收集同濟大學附屬同濟醫(yī)院82例手術切除的患者肺腫瘤標本，其中37例鱗癌標本，45例腺癌標本，對所有腫瘤標本做免疫組化檢測。另外獲取30例健康人肺組織標本作為陰性對照。在獲取肺腫瘤標本時，患者均未接受過任何治療。實驗設計通過醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.1.2 細胞株和小鼠

人肺腺癌細胞A549細胞和鼠Lewis肺癌細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。C57BL/6小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。

1.1.3 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)購自美國Invitrogen公司，青霉素、鏈霉素購自澳大利亞PAA Laboratories公司，Transwell?插入式細胞培養(yǎng)皿購自美國BD公司，總蛋白裂解液、兔抗GSK-3β(pSer9)、Akt(pSer473)、total β-catenin抗體購自美國Cell Signalling Technology公司，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)中和抗體購自美國R&D Systems公司，免疫球蛋白IgG購自美國Santa Cruz公司，鼠抗無磷酸化β-catenin抗體購自美國Millipore公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體、兔抗-TNF-α抗體購自英國Abcam公司，兔抗鼠抗體、鼠抗人-CD68購自丹麥Dako公司，兔抗鼠-CD68購自美國Abbiotec公司，β-actin購自美國Sigma公司，EnVision?+System-HRP(AEC)試劑盒購自丹麥Dako公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

細胞株以DMEM完全培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 人巨噬細胞的采集、分離和培養(yǎng)

按照參考文獻［5-6］的方法，用淋巴細胞分離液收集人外周血中的單個核細胞。經過PBS洗滌后，將細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，加50 ng/mL M-CSF培養(yǎng)7 d，使其分化為巨噬細胞，經形態(tài)學和巨噬細胞表面標志分子CD14、CD68鑒定后用于隨后實驗。

1.2.3 動物模型的建立及香煙煙霧刺激方法

按照參考文獻［1,7］的方法，將5×105個Lewis肺癌細胞通過尾靜脈法注射到C57BL/6小鼠體內(n=30)。7 d后，小鼠被隨機平均分為2組，1組為吸煙組，1組為空氣組。吸煙組中，小鼠暴露于香煙煙霧的環(huán)境中7 d，每天5次、每次20 min進行香煙煙霧刺激，小鼠在最后1次香煙煙霧刺激后24 h內被處死，進行小鼠肺腫瘤組織中巨噬細胞的浸潤、TNF-α及無磷酸化β-catenin的表達檢測；空氣組小鼠置于過濾空氣環(huán)境中，作為對照。小鼠香煙煙霧暴露使用意大利Comerio VA公司吸煙機器(Ugo Basile 7025 rodent ventilator)，將香煙點燃后，儀器恒定地以270 mL/min的固定速度產生煙霧并用1 800 mL/min的新鮮空氣稀釋后，直接釋放入安置小鼠的有機玻璃盒內。該盒內的平均總懸浮顆粒物質濃度在400～425 mg/m3之間。

1.2.4 香煙提取物(cigarette smoke extract，CSE)的制備

按照參考文獻［1,8］的方法，2支香煙點燃后，煙霧通過負壓泵抽入20 mL無血漿的DMEM培養(yǎng)液中，燃燒速度為1支/min。然后將培養(yǎng)液pH值調至7.4，經0.2 μm的濾菌器消毒，分裝后-80 ℃保存待用。以此濃度的CSE為100%。0.1%、0.25%和0.5%濃度的CSE是按體積比用無血漿的DMEM培養(yǎng)液稀釋而成的。

1.2.5 肺癌細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)并用CSE處理

按照參考文獻［1,5,8］的共培養(yǎng)方法，共培養(yǎng)使用孔徑為0.4 μm的Transwell?插入式細胞培養(yǎng)皿，將對數生長期的A549細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，常規(guī)培養(yǎng)72 h。具體方法：①CSE直接處理A549細胞，將A549細胞培養(yǎng)在6孔細胞培養(yǎng)板中，過夜后，將培養(yǎng)基棄去，PBS清洗1次，加入含不同濃度CSE的完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)72 h后收集A549細胞總蛋白待測；②CSE處理共培養(yǎng)條件下的A549細胞與巨噬細胞，將A549細胞培養(yǎng)在6孔細胞培養(yǎng)板中，巨噬細胞培養(yǎng)在Transwell?培養(yǎng)皿中，過夜后將培養(yǎng)基棄去，PBS清洗1次，加入含不同濃度CSE的完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)72 h后集收集A549細胞總蛋白待測；③TNF-α中和實驗中，在CSE處理共培養(yǎng)條件下的A549細胞與巨噬細胞的同時，在培養(yǎng)基中加入10 μg/mL的TNF-α中和抗體或10 μg/mL對照免疫球蛋白IgG。

1.2.6 細胞總蛋白的提取及蛋白質印跡法(Western blot)檢測

按照參考文獻［5-6］的方法，A549細胞經PBS清洗后，用50～100 μL的總蛋白裂解液裂解細胞，冰上放置1 h。4 ℃，10 000 r/min離心15 min，上清液即為抽提的總蛋白。經BCA方法定量后，取40 μg總蛋白與等體積2×上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸3～5 min變性，上樣于10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。常規(guī)轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉1 h。加入用含5%脫脂奶粉的TBS-T稀釋的一抗，4 ℃溫育過夜。經TBS-T充分洗滌，加入用含5%脫脂奶粉的TBS-T稀釋的HRP-兔抗鼠抗體(1∶2 000)以及HRP-羊抗兔抗體(1∶5 000)室溫反應1 h，TBS洗滌，用美國Cell Signalling Technology公司ECL化學發(fā)光試劑盒顯影。

1.2.7 免疫組化檢測

用4%的甲醛溶液將肺腫瘤組織固定后，石蠟包埋、切片。切片經60 ℃溫育過夜后脫蠟，再將其放于0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中，用微波爐于100 ℃加熱20 min進行抗原修復。切片用3%的H2O2抑制非特異性氧化酶后，在2%封閉液中溫育60 min，然后加一抗4 ℃溫育過夜，根據EnVision?+System-HRP(AEC)試劑盒說明書進行二抗的溫育和染色，復染使用蘇木精。這期間應用以下抗體：兔抗-CD68 (應用于鼠，1∶200)、鼠抗-CD68(應用于人，1∶100)、兔抗-TNF-α(1∶100)和鼠抗-無磷酸化β-catenin(1∶50)。CD68+細胞統計方法：在腫瘤組織中隨機選取6個顯微鏡高倍視野，計數CD68+細胞總數，然后除以6取得平均值，即為每高倍視野CD68+細胞數目。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 小鼠肺腫瘤組織中巨噬細胞的浸潤、TNF-α及無磷酸化β-catenin的表達

免疫組化染色結果表明，在香煙煙霧的刺激下，在腫瘤負荷小鼠的肺腫瘤組織中顯示，浸潤到腫瘤組織中的巨噬細胞CD68+的數量顯著高于空氣對照組(圖1、2)。腫瘤組織中TNF-α的表達在吸煙組和空氣對照組中的差異有統計學意義(P＜0.05)。吸煙組肺腫瘤中表達TNF-α的炎性反應細胞明顯多于空氣對照組。在吸煙組的小鼠肺腫瘤細胞中無磷酸化β-catenin的表達顯著高于空氣對照組(圖1)。

圖1 空氣對照組與吸煙組小鼠肺腫瘤組織CD68、TNF-α及無磷酸化β-catenin免疫組化染色結果Fig. 1 Immunohistochemical analysis of CD68, TNF-α and unphosphorylated β-catenin in smoke or air treated lung tumors of mice(EnVision, ×200)

圖2 CD68+細胞在空氣組和吸煙組肺腫瘤組織中的計數Fig. 2 Numbers of CD68+cells in lung tumor tissues of air group and smoke group

2.2 肺癌患者腫瘤組織CD68、TNF-α和無磷酸化β-catenin的表達

免疫組化檢測結果顯示，在全部檢測的82例肺腺癌和鱗癌腫瘤組織中，CD68+的巨噬細胞以及TNF-α表達陽性的炎性反應細胞數顯著多于正常肺組織(圖3)。無磷酸化β-catenin在肺腺癌和鱗癌腫瘤組織中的表達也顯著高于正常組織(圖3)。在肺腺癌腫瘤組織中，有31例(68.9%)標本無磷酸化β-catenin染色陽性；在肺鱗癌腫瘤組織中，有23例(62.2%)標本無磷酸化β-catenin染色陽性(表1)。無磷酸化β-catenin的陽性率與患者的吸煙狀態(tài)和腫瘤的分期有關，在吸煙患者癌組織中，無磷酸化β-catenin陽性率高于不吸煙患者(P＜0.05)；Ⅲ～Ⅳ期癌組織中無磷酸化β-catenin陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.05，表1)。同時結果也發(fā)現，在無磷酸化β-catenin染色陽性的標本中，CD68染色陽性的細胞數明顯高于無磷酸化β-catenin染色陰性肺癌標本的細胞數(P＜0.01，圖4)。

圖3 NSCLC組織CD68、TNF-α及無磷酸化β-catenin的表達Fig. 3 Immunohistochemical analysis of CD68, TNF-α and unphosphorylated β-catenin in NSCLC tissues

表1 在82例NSCLC組織中無磷酸化β-catenin組化檢測及其臨床病理特征關系Tab. 1 The correlation of unphosphorylated β-catenin staining and clinicopathological features in 82 NSCLS tissues

圖4 CD68+細胞在無磷酸化β-catenin染色陽性和陰性的肺腺癌和肺鱗癌腫瘤組織中的計數Fig. 4 CD68+cells counting in adenocarcinoma or squamous cell carcinoma with positive or negative unphosphorylated β-catenin staining

2.3 巨噬細胞釋放的TNF-α激活腫瘤細胞Wnt/β-catenin途徑

Western blot檢測結果顯示，不同濃度(0%～0.5%)的CSE直接處理A549細胞72 h后，無磷酸化β-catenin的表達無顯著變化，但是當A549細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)后，隨著CSE濃度的增加，A549細胞中無磷酸化β-catenin的表達顯著上調，并顯示出部分CSE劑量依賴性表達(圖5A)。在巨噬細胞和A549細胞共培養(yǎng)條件下，與對照組相比，加入10 μg/mL的TNF-α中和抗體后顯著抑制A549細胞無磷酸化β-catenin的表達(圖5B)。用100 ng/mL的TNF-α處理A549細胞，磷酸化的GSK-3β和Akt蛋白在TNF-α處理2 h后就表達增加，4 h后無磷酸化β-catenin蛋白表達也開始上調(圖5C)。

圖5 TNF-α激活Wnt/β-catenin途徑Fig. 5 TNF-α activated Wnt/β-catenin signaling pathway

3 討 論

香煙作為導致肺癌的重要因素已被人們熟知，而其具有的促進腫瘤生長的特性，目前也已被包括多項研究證實［1-2,8-9］。前期研究表明在采用注射腫瘤細胞、化學致癌物NNK或K-ras轉基因小鼠等方法導致的肺癌小鼠模型中，香煙煙霧的刺激顯著增加了肺腫瘤的生長［1,9］。有研究顯示，香煙煙霧刺激產生的炎性反應被認為可能關聯到肺腫瘤的生長［1,9］。通過敲除小鼠髓系細胞p65或IKKβ阻斷炎性反應免疫細胞的NF-kB信號途徑，顯著抑制香煙煙霧誘發(fā)的小鼠肺部炎性反應，導致小鼠肺腫瘤生長阻滯［2,9］。本研究結果發(fā)現，大量的巨噬細胞浸潤到小鼠肺腫瘤組織中，并且浸潤到腫瘤組織的炎性反應細胞表達高濃度的TNF-α，特別是當小鼠經過香煙煙霧刺激后，TNF-α的表達進一步增加。在巨噬細胞中，TNF-α表達主要由NF-kB途徑控制，是巨噬細胞分泌的主要炎性細胞因子［10］。

Wnt/β-catenin是胚胎肺組織發(fā)育的重要信號途徑，是Wnt蛋白家族的經典信號途徑，它的激活需要依賴細胞質中β-catenin蛋白的磷酸化［11］。當Wnt未與細胞膜上的配基結合時，細胞質中的β-catenin被由GSK-3β、酪蛋白激酶1、Axin和腺瘤結腸息肉病組成的破壞復合物磷酸化，進而通過泛素-蛋白酶體途徑被降解。而當Wnt與其配體Frizzled和低密度脂蛋白受體相關蛋白受體結合后，通過激活磷酸化蛋白散亂蛋白，進而破壞復合物的功能，使其β-catenin蛋白不能被磷酸化。這樣非磷酸化的β-catenin蛋白進入細胞核與相應的靶基因如Cyclin D1、c-Myc等結合，進而啟動這些基因的轉錄表達。近年的研究表明Wnt/β-catenin信號途徑的激活同樣涉及肺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［12］。相關臨床研究顯示，異常的Wnt/β-catenin表達可能是非小細胞肺癌預后較差的一個獨立的標志［13］。香煙煙霧可以通過激活Wnt/β-catenin途徑，導致人正常支氣管表皮細胞的惡性轉變［14］。本研究表明，人或小鼠的肺腫瘤組織均有非磷酸化β-catenin表達，特別是經過香煙煙霧的刺激后，無磷酸化β-catenin的表達顯著增加，提示Wnt/β-catenin信號途徑可能參與吸煙者肺癌的發(fā)病。

在本研究中，CSE誘導的A549細胞Wnt/ β-catenin信號激活需要巨噬細胞的存在，說明經香煙煙霧刺激后，巨噬細胞釋放的某些可溶性的因子可能參與肺癌細胞Wnt/ β-catenin信號的激活。已有研究顯示，Wnt/ β-catenin信號的激活涉及TNF-α誘導的胃癌形成過程［4］。本研究結果顯示，TNF-α的刺激顯著激活肺腺癌A549細胞的Wnt/β-catenin信號途徑。在巨噬細胞與A549細胞共培養(yǎng)體系中加入TNF-α中和抗體能顯著地抑制無磷酸化β-catenin表達，提示TNF-α具有上調Wnt/β-catenin信號的功能。GSK-3β是Wnt/ β-catenin信號途徑的主要抑制因子，它通過磷酸化β-catenin上一系列保守的絲氨酸和蘇氨酸殘基，致使β-catenin蛋白降解［15］。Akt能夠通過磷酸化GSK-3β激活β-catenin的轉錄活性［4］。本研究通過Western blot檢測證明，TNF-α通過激活Akt信號途徑，致使GSK-3β磷酸化并抑制GSK-3β功能，從而上調無磷酸化β-catenin的表達，激活Wnt/β-catenin信號途徑。

綜上所述，本研究結果顯示，香煙煙霧誘導了巨噬細胞的腫瘤浸潤并激活其炎性反應因子如TNF-α的表達和釋放，進而通過Akt/GSK-3β途徑激活肺腫瘤細胞Wnt/β-catenin信號通路，初步闡明香煙煙霧促進肺腫瘤發(fā)展的分子機制。

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The study on mechanisms of Wnt/β-catenin signaling activation by smoke from cigarette in lung cancer cell

LI Dong, WAN Hai-ying, YAO Yi-wen, WU Jun-lu, QUAN Wen-qiang, ZHOU Hong, ZHANG

Yu
(Department of Clinical Laboratory, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China)

LI Dong E-mail: 186ld@163.com

Background and purpose: Cigarette smoke-induced inflammatory response remarkably promotes lung tumor growth. This study aimed to elucidate the mechanism of Wnt/β-catenin signaling activation by cigarette smoke in lung cancer cells. Methods: To understand the effect of cigarette smoke on mice, a kind of metastatic lung cancer mouse model which was established by intravenous injection of Lewis lung carcinoma cells. By immunohistochemical analysis, we analyzed the expression of CD68 (macrophage marker), TNF-α and unphosphorylated β-catenin in mice and human lung cancer samples. To coculture human lung adenocarcinoma cell line A549 cells with macrophages, the “Transwell?Inserts” system was used in coculturing model. The expressions of unphosphorylated β-catenin, phosphorylated GSK-3β and Akt in A549 cells were detected by Western blot assay. Results: The immunohistochemical results showed positive staining for CD68, TNF-α and unphosphorylated β-catenin increased significantly in smoke-exposed mice compared to air exposure mice. In human lung cancer samples, CD68 and TNF-α expressions were significantly higher than in healthy lung tissue. The positive staining rates of unphosphorylated β-catenin in lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma were 68.9% and 62.2%, respectively.This positive rate had a relationship with smoking status and tumor stage, there was statistical significance (both P＜0.05). It also showed the number of CD68+cells had a signi fi cant increase in tumors positive for unphosphorylated β-catenin (P＜0.01). Western blot results showed that the expression of unphosphorylated β-catenin in A549 cells had a signi fi cant concentration-dependent increase of CSE after coculturing with macrophages. The neutralizing antibody against TNF-α could signi fi cantly suppressed unphosphorylated β-catenin in A549 cells. TNF-α exposure resulted in phosphorylation of GSK-3β and Akt in A549 cells after 2 h and the expression of unphosphorylated β-catenin increased 4 h later. Conclusion: Cigarette smoke induces TNF-α release from macrophages in lung tumor tissue, which could activate the Wnt/β-catenin pathway of tumor cells through Akt/GSK-3β.

Macrophages; Lung cancer; Tumor necrosis factor alpha; Wnt/β-catenin pathway

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.12.001

R734.2

A

1007-3639(2014)12-0881-08

2014-05-28

2014-07-30）

國家自然科學基金(81272603、81472179)；上海市浦江人才計劃(13PJ1407300)；上海申康醫(yī)院發(fā)展中心課題(SHDC22014008)。

李冬 E-mail:186ld@163.com