四妙勇安湯合生脈飲對缺氧乳鼠心肌細胞活性及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的影響※

孟云輝 于慧卿 王 強 李武衛(wèi) 劉曉燕

(河北省石家莊市中醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

四妙勇安湯合生脈飲對缺氧乳鼠心肌細胞活性及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的影響※

孟云輝 于慧卿 王 強 李武衛(wèi) 劉曉燕

(河北省石家莊市中醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

目的 觀察四妙勇安湯合生脈飲對缺氧乳鼠心肌細胞活性及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的影響。方法 應(yīng)用醇沉技術(shù)制備四妙勇安湯合生脈飲藥液，采用胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合消化的方法分離SD乳鼠心肌細胞，采取2次差速貼壁法對心肌細胞進行純化，原代培養(yǎng)。利用高純氮氣建立心肌細胞缺氧/復(fù)氧模型。原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞隨機分為3組，即正常對照組、模型組及藥物干預(yù)組。采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測心肌細胞活性，采用全自動生化分析儀檢測心肌細胞培養(yǎng)液AST的含量。結(jié)果 藥物干預(yù)組能提高乳鼠心肌細胞OD值，降低AST含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 四妙勇安湯合生脈飲可能提高缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細胞的活性，降低AST含量，從而對心肌細胞具有保護作用。

四妙勇安湯;生脈飲;心肌疾病;肌細胞，心臟;模型，動物;動物實驗

近年來實驗研究顯示，四妙勇安湯具有抗動脈粥樣硬化、保護血管新生的作用［1］。部分臨床試驗表明，四妙勇安湯加味對冠心病及急性心肌梗死患者療效確切［2］。生脈飲臨床主要用于冠心病心肌梗死、心力衰竭及各種休克的治療。四妙勇安湯合生脈飲是否能夠起到保護心肌細胞的作用很少報道，本研究通過實驗觀察四妙勇安湯合生脈飲對缺氧乳鼠心肌細胞活性及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的影響，以為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD乳鼠20只，出生24 h以內(nèi)，SPF級，雌雄不限，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號:1308037。

1.1.2 藥材及試劑 四妙勇安湯合生脈飲藥物組成:金銀花 30 g，玄參 30 g，當歸 15 g，甘草 6 g，人參 9 g，麥門冬9 g，五味子6 g。中藥材由河北省石家莊市中醫(yī)院中藥房提供。胰蛋白酶(美國Sigma公司)，Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)，AST試劑盒(上海豐匯醫(yī)用儀器有限公司)。

1.1.3 主要儀器 311型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，全自動生化分析儀(日本東芝)，酶標儀(奧地利TECAN公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液制備 按上方準確稱取每味中藥，加入13倍的去離子水2 925 mL(即1 g生藥加13 mL去離子水)，浸泡30 min后，急火煎煮1.5 h，16層紗布過濾，濾出藥渣，隔水濃縮至生藥濃度為2.65 g/mL的藥液，此時(60℃)藥液相對密度為1.21 g/mL。冷卻后加無水乙醇，使含醇量達75%，充分攪拌，4℃沉淀24 h，濾取上清，水浴濃縮成稠膏。檢測pH值7.1～7.2，密封，4℃保存?zhèn)溆?。使用時加培養(yǎng)液稀釋成生藥濃度為133 μg/mL的使用液，細菌過濾器過濾后使用。

1.2.2 SD乳鼠原代培養(yǎng)心肌細胞方法及鑒定 用75%酒精消毒SD乳鼠皮膚，組織剪剖開胸部，換組織鑷取下心臟，置入盛有預(yù)冷的D-hanks液的培養(yǎng)皿中，換組織剪與組織鑷，輕輕洗去心臟上的血細胞，剪取心尖部，再用預(yù)冷的D-hanks液漂洗2～3次，洗凈殘血直至組織塊變白，置入青霉素小瓶中，剪成大小約1 mm3小塊。用0.08%胰蛋白酶與0.1%Ⅱ型膠原酶(等量混勻)消化，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾去除未消化的組織及細胞團后，離心沉淀收集細胞，選擇700～1 000 r/min，離心5 min，所獲細胞沉淀用完全培養(yǎng)基懸浮;再經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，再離心1次，加適量完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞，移入培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 分組及給藥方法 將原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞隨機分為3組。正常對照組:不進行缺氧/復(fù)氧處理，也不加四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液進行干預(yù);模型組:進行缺氧/復(fù)氧處理，但不加四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液干預(yù);藥物干預(yù)組:進行缺氧/復(fù)氧處理，同時進行四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液干預(yù)。實驗開始時正常對照組更換完全培養(yǎng)基入培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h;模型組及藥物干預(yù)組更換無糖無血清培養(yǎng)液，缺氧培養(yǎng)4 h，隨后模型組更換完全培養(yǎng)基，藥物干預(yù)組更換含有10%四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液的完全培養(yǎng)基，復(fù)氧2 h，根據(jù)不同實驗?zāi)康挠糜趯嶒灐?/p>

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測心肌細胞活性

將心肌細胞接種于96板中，每孔200 μL，細胞密度3×105/mL。參照1.2.3項分組分別建立96孔板中缺氧模型并進行實驗分組。每組均設(shè)8個復(fù)孔。將MTT溶液配成終濃度為0.5 mg/mL的使用液。缺氧/復(fù)氧結(jié)束后，棄去96孔板中的培養(yǎng)液，用D-hanks液輕輕地沖洗2次，每孔加入MTT溶液100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。取出培養(yǎng)板棄去原MTT溶液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL溶解沉淀，微量振蕩器振蕩15～20 min。在酶標儀上采用波長490 nm檢測各孔光密度值(OD)。同時設(shè)空白對照孔，作為空白孔調(diào)零，不加細胞只加培養(yǎng)液，其他實驗步驟相同。

1.3.2 心肌細胞培養(yǎng)液中AST含量檢測 在缺氧/復(fù)氧實驗結(jié)束后，留取正常對照組、模型組及藥物干預(yù)組各組心肌細胞培養(yǎng)液3 mL，4℃貯存，留取樣本6份。樣本室溫放置 30 min后 1 000 r/min，離心 5 min，取上清液0.2 mL，按AST試劑盒操作說明加入試劑一［100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.26 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)溶液、3.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、3.0 kU/L 乳酸脫氫酶］2 mL，再加入試劑二［100 mmol/L Tris、240 mmol/L L- 天冬氨酸、12 mmol/L α-酮戊二酸、1.0 kU/L氫氧化鎂(MDH)2 mL］，混勻后置37℃孵育60～300 s，然后上全自動生化分析儀檢測心肌細胞培養(yǎng)液中AST的含量。分別于60、120 s時讀取吸光度值，使用蒸餾水在340 nm處調(diào)零。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組乳鼠心肌細胞活性比較 見表1。

由表1可見，與正常對照組比較，模型組OD值明顯降低(P＜0.05)，心肌細胞數(shù)量減少;與模型組比較，藥物干預(yù)組OD值增高(P＜0.05)，但仍較正常對照組減少(P＜0.05)。

表1 各組乳鼠心肌細胞活性比較±s

表1 各組乳鼠心肌細胞活性比較±s

與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05

組 別 n OD值0.274 ±0.012模型組 8 0.189 ±0.020*藥物干預(yù)組 8 0.223 ±0.018正常對照組8＊△

2.2 各組乳鼠心肌細胞AST含量比較 見表2。

表2 各組乳鼠心肌細胞AST含量比較U/L，±s

表2 各組乳鼠心肌細胞AST含量比較U/L，±s

與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05

組 別 n AST正常對照組1.02 ±0.45模型組 6 3.96 ±0.88*藥物干預(yù)組 6 2.55 ±0.67 6＊△

由表2可見，模型組AST含量較正常對照組升高(P＜0.05)，藥物干預(yù)組 AST含量較模型組降低(P＜0.05)，但仍高于正常對照組(P＜0.05)。

3 討論

四妙勇安湯是一首治療脫疽的經(jīng)典古方，由金銀花、玄參、當歸、甘草組成，具有清熱解毒、活血止痛的功效。生脈飲是一首治療氣陰兩虛證的經(jīng)典古方，由人參、麥門冬、五味子組成，具有益氣生津、斂陰止汗功效。

MTT比色法可用于研究心肌細胞的存活力［3］，是一種檢測細胞存活和生長的方法。MTT法的原理是活細胞線粒體含有的琥珀酸脫氫酶能夠還原外源性的黃色MTT為不溶于水的紫藍色沉淀物，這種沉淀物被稱之為甲瓚(Formazan)并沉積于細胞中，但是死細胞則沒有此種反應(yīng)。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，甲瓚的形成量與活細胞數(shù)量成正比，甲瓚形成量能夠間接反映細胞的存活力。DMSO能溶解細胞中的沉淀物甲瓚，在酶標儀上選擇波長490 nm處檢測這種物質(zhì)的光吸收值，從而間接地相對地反映存活狀態(tài)的心肌細胞的數(shù)量，也就能夠反映細胞的存活力。這種比色法的優(yōu)點是靈敏度相對較高，經(jīng)濟，操作比較簡單，能客觀準確反映細胞的生存活力與藥物作用的關(guān)系［4］;缺點是這種比色法只能用來檢測細胞的相對數(shù)量，不能檢測細胞的絕對數(shù)量，而且最重要的是該實驗方法只能檢測活細胞，對凋亡細胞、壞死細胞不能進行檢測。本實驗結(jié)果表明，藥物干預(yù)組心肌細胞OD值明顯高于模型組(P＜0.05)，心肌細胞活性增強?？赡苁撬拿钣掳矞仙}飲醇沉藥液保護了缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細胞的線粒體結(jié)構(gòu)或者功能，從而促使甲瓚的生成量增多，顯示該藥液具有增加缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細胞存活力的作用，可能起到了抑制心肌細胞凋亡的作用。

AST是臨床上心肌酶化驗項目中的一項，AST在心肌細胞中的含量最多，在肝臟及骨骼肌等器官組織中也含有AST，在血清中含量極少。對于在體外培養(yǎng)的心肌細胞，檢測AST可以排除肝臟及骨骼肌對培養(yǎng)液中AST含量的影響。正常的心肌細胞幾乎不釋放AST。缺氧后心肌細胞的能量供應(yīng)從有氧氧化轉(zhuǎn)為無氧酵解，能量供應(yīng)明顯減少，細胞膜功能受損，通透性增大［5］，細胞對一定時間缺血缺氧后突然恢復(fù)的高濃度氧不能適應(yīng)，細胞內(nèi)生成大量的氧自由基導(dǎo)致細胞及細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，心肌細胞內(nèi)釋放大量酶［6］。本實驗表明，與正常對照組相比，模型組、藥物干預(yù)組培養(yǎng)液中AST含量升高(P＜0.05);而與模型組相比較，加入四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液后的藥物干預(yù)組AST含量降低(P＜0.05)。從而可以推測，四妙勇安湯合生脈飲能夠減輕缺氧/復(fù)氧后對心肌細胞造成的損傷，有可能是通過改善細胞的有氧代謝及抑制氧自由基對細胞的損傷從而改善細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能的通透性，減少細胞釋放到培養(yǎng)液中AST含量，從而起到了對心肌細胞的保護作用。

本研究表明，四妙勇安湯合生脈飲對缺氧乳鼠心肌細胞凋亡具有保護作用，其作用可能與四妙勇安湯合生脈飲能夠提高缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細胞的存活力、降低缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細胞培養(yǎng)液中AST含量有關(guān)。

［1］劉真，魏運湘，于慧卿，等.四妙勇安湯對缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細胞的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17(5):31-33.

［2］魏運湘，劉真，于慧卿，等.四妙勇安湯加味對急性心肌梗死患者心肌保護作用的療效觀察［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8(6):664-665.

［3］關(guān)鳳英，李紅，孫巍.黃芪甲苷對新生乳鼠心肌細胞過氧化氫損傷的保護作用［J］.吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2007，33(2):211-214.

［4］余薇，查文良，吳基良，等.原代培養(yǎng)的心肌細胞中毒性心肌炎模型的建立［J］.山東醫(yī)藥，2008，48(2):6-7.

［5］張連東，楊興易.MODS患者血清心肌酶變化及臨床意義［J］.中國急救醫(yī)學(xué)，2004，24(9):691.

［6］方顯明，楊建設(shè)，顧國龍，等.益心脈顆粒對家兔心肌缺血再灌注心肌損傷保護作用的研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2003，10(2):78-80.

(本文編輯:曹志娟)

Investigation of Simiao Yongan decoction with Shengmai drink on AST and cardiomyocytes activity of hy-poxic neonatal rat

MENG Yunhui，YU Huiqing，WANG Qiang，et al.Department of Cardiology，Shijiazhuang Hospital of Traditional Chinese Medicine in Hebei Province，Hebei，Shijiazhuang050051

ObjectiveTo observe the effect of Simiao Yongan decoction combined with Shengmai drink on AST and cardiomyocytes activity of hypoxic neonatal rat.MethodsSimiao Yongan decoction with Shengmai drink was decocted and made by alcohol sedimentation.The combination of trypsin and collagenase was to isolate neonatal rat myocardial cells，which were purified twice by differential adhesion method and identified by immunocytochemical Methods Primary cultured neonatal rat cardiomyocytes were randomly divided into three groups，control group，model group，and treatment group.The myocardium viability was detected by MTT colorimetric method.And AST was determined by automatic biochemical analyzer.ResultsDrug intervention can improve the OD value of each well，lower AST levels，compared with the model group，the difference was significant(P＜0.05).ConclusionThe alcohol sedimentation solution of Simiao Yongan decoction with Shengmai drink played a protective role on myocardial apoptosis，which may be relative with the improvement of the myocardium viability and the decline of the AST content in culture media induced by hypoxia/reoxygenation treatment.

Simiao Yongan decoction;Shengmai drink;Cardiomyopathy;Myocyte;Heart;Model;Animal;Animal experiment

R542.2;R285.5;R289.3

A

1002-2619(2014)08-1228-03

※項目來源:河北省中醫(yī)藥管理局2011年度中醫(yī)藥類科研計劃課題(編號:2011053)

孟云輝(1977—)，女，中西醫(yī)結(jié)合副主任醫(yī)師，博士。從事心血管疾病臨床研究。

2013-08-15)