吳曉毅+巢志茂+孫文+王淳

[收稿日期] 2014-01-28

[基金項目] 人力資源和社會保障部留學人員科技活動項目（人社廳函[2011]508號）

[通信作者] *巢志茂，研究員，Tel：（010） 64014411-2869，F(xiàn)ax：（010） 64013996，E-mail：chaozhimao@163.com

[作者簡介] 吳曉毅，博士研究生，E-mail：wuxiaoyi0000@126.com

[摘要] 白芷中的香豆素類成分在硫磺熏蒸后顯著下降，因此需要對硫磺熏蒸的白芷建立快速定性鑒別，并建立歐前胡素含量定量模型，實現(xiàn)藥材質(zhì)量控制的目的。該文使用近紅外（NIR）漫反射光譜技術采集硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸的白芷的NIR光譜，以一階導數(shù)和矢量歸一化的方法進行預處理，采用OPUS/INDENT定性分析軟件Ward′s Algorithm法進行聚類分析，在8 806.0～3 811.0 cm^-1的聚類分析結果可以簡單，快速地鑒別白芷是否被硫磺熏蒸。同時，以高效液相色譜法測定的歐前胡素分析值為參照，結合OPUS/QUANT定量分析軟件偏最小二乘法，建立歐前胡素含量的定量模型。該模型的相關系數(shù)（R2），內(nèi)部交叉驗證均方差（RMSECV）和預測均方差（RMSEP）分別為0.982 8，0.006 8和0.011 8。建立的歐前胡素NIR定量模型可準確地用于快速測定白芷中歐前胡素的含量。

[關鍵詞] 白芷；近紅外光譜；硫磺熏蒸；聚類分析；歐前胡素

中藥白芷，為傘形科植物白芷Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f.或杭白芷A. dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f. var. formosana （Boiss.） Shan et Yuan的干燥根。性溫味辛，歸胃、大腸、肺經(jīng)，具有解表散寒、祛風止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿的功效，主要用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻淵、牙痛、帶下、瘡瘍腫痛等^[1]。白芷的傳統(tǒng)產(chǎn)地加工方法主要采用硫磺熏蒸法，可使藥材快速干燥，并解決藥材顏色發(fā)黃和生蟲等問題^[2]。但近年來的研究表明，白芷硫磺熏蒸后，其中的香豆素類成分及藥效活性均顯著降低^[3-7]。因此，鑒別硫磺熏蒸樣品，并完成白芷的質(zhì)量控制指標——歐前胡素的含量測定對藥材質(zhì)量控制以及用藥規(guī)范有重要的意義。當前鑒別硫磺熏蒸藥材及飲片的常用檢測方法有二氧化硫殘留量測定法^[8]、改良古蔡氏法^[9]、碘滴定-氯化鋇反應法^[10]等，白芷中歐前胡素的含量常用高效液相色譜法進行測定[1，11]。這些鑒別和測定方法都需要對樣品進行損害性處理。近年來，近紅外光譜（NIR）技術因具有操作簡便、分析速度快、對樣品無損害、無化學污染和可實現(xiàn)在線控制的優(yōu)點，得到了迅速的發(fā)展和利用^[12]，在藥物定性和定量分析中受到了廣泛重視和應用^[13-15]。本文將近紅外技術與化學計量學相結合，采用聚類分析法完成了硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸白芷的分類；同時采用偏最小二乘法建立歐前胡素定量分析模型，實現(xiàn)了白芷中歐前胡素含量的快速、簡便和準確測定。這些方便簡捷、不損害樣品的NIR技術，對白芷具有快速的質(zhì)量評價價值。

1 材料

BRUKER MPA 型傅里葉變換近紅外光譜儀，配有漫反射附件、樣品旋轉器和石英樣品杯、 PbS檢測器、OPUS/INDENT定性分析軟件、OPUS/QUANT定量分析軟件（德國BRUKER公司）；島津LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）。

歐前胡素對照品（成都普思生物科技有限公司，批號101228-01），乙腈、甲醇（色譜純，Merck公司），純水（娃哈哈純凈水），其他所用試劑均為分析純。

2012年10月，從河北安國市15個自然村的29個地塊隨機采挖白芷的根，除去泥土，晾干。每個地塊選擇大小一致、無病蟲害、無機械損傷的白芷6根。其中3根趁新鮮直接切片后晾干，即為非硫磺熏蒸的自然陰干的白芷藥材，編號1NS至29NS；另3根進行了48 h的硫磺熏蒸，直到出現(xiàn)"淌淚"為止，即藥材變軟、表皮有少量液體滲出，達到傳統(tǒng)的硫磺熏蒸產(chǎn)地加工的基本要求，隨后切片，晾干，即為硫磺熏蒸后的白芷藥材，編號為30S至58S，見表1。1NS和30S，2NS和31S，3NS和32S，……以此類推，均為同一個地塊的新鮮白芷根的2種不同加工方法獲得的實驗樣本。樣品經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所巢志茂研究員鑒定為傘形科當歸屬植物白芷A. dahurica的根。

2 方法

2.1 近紅外光譜采集

取全部58個樣品，粉碎，過80目篩，40 ℃烘12 h，每批樣品取4 g，混合均勻后放入石英樣品杯中，輕輕振蕩使分布均勻，采用積分球漫反射測樣，分辨率8 cm^-1，掃描64次，掃描范圍12 500.0～3 500.0 cm^-1，溫度（25±1） ℃；相對濕度40%。每批樣品重復采集3張光譜，取其平均光譜用于數(shù)據(jù)處理。58個樣品的NIR光譜疊加圖見圖1。

圖1 58個樣品的NIR光譜疊加圖

Fig.1 The overlapped near-infared spectra of 58 samples

2.2 歐前胡素含量測定

2.2.1 色譜條件 Dikma色譜住[Diamonsil（R）-C18， 4.6 mm×250 mm，5 μm]，柱溫35 ℃，流動相乙腈-水（0～10 min，10%～20%乙腈；10～18 min，20%～35%乙腈；18～48 min，35%～55%乙腈；48～68 min，55%～75%乙腈；68～75 min，75%～90%乙腈），流速1.0 mL·min^-1，選用210～800 nm的Max Plot色譜圖。endprint

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定歐前胡素4.90 mg，置于20 mL棕色量瓶中，色譜純甲醇溶解，稀釋至刻度搖勻，制備成質(zhì)量濃度為0.245 g·L^-1的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取1 g白芷藥材粉末（過80目篩）于100 mL燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，稱重，水浴加熱回流提取2 h，冷卻后補重，過濾，取續(xù)濾液。精密量取5 mL續(xù)濾液，減壓回收溶劑至干，用色譜純甲醇定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜，供HPLC分析。

2.2.4 樣品的含量測定與含量分布 精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，分別按2.2.1項方法進行測定，色譜圖見圖2，計算得到30個樣品的歐前胡素質(zhì)量分數(shù)為0.066%～0.257%。其中，質(zhì)量分數(shù)0.100%～0.199%的樣品達到樣品總數(shù)的60%^[16]，該含量分布情況有利于準確建立定量模型。

A.對照品溶液； B.供試品溶液： 1.歐前胡素。

圖2 對照品與供試品HPLC圖

Fig.2 HPLC chromatographies of reference standard and sample

2.3 定性鑒別方法

用于定性鑒別的58個樣品的NIR光譜原始譜圖經(jīng)21點平滑后進行一階導數(shù)求導，采用矢量歸一化法進行預處理，在8 806.0～3 811.0 cm^-1的光譜區(qū)段內(nèi)提取樣品的光譜信息。采用OPUS軟件中的標準法，依據(jù)歐式距離公式計算譜圖與譜圖之間的距離，根據(jù)計算的距離大小，通過OPUS/INDENT定性分析軟件中的Ward′s Algorithm法進行聚類分析。

歐式距離公式為Dij=∑ K（Aik-Ajk）2，其中，Aik和Ajk分別為i光譜和j光譜在波長點k處的吸光度。

Ward′s Algorithm法是從方差分析的角度出發(fā)，要求分類的結果是類內(nèi)方差盡量小，類間方差盡量大。

2.4 建立歐前胡素定量模型的方法

采用交叉驗證法，對2.2.4中進行含量測定的30個樣品按照歐前胡素含量大小排序，均勻選擇22個樣品作為校正集，剩下的8個樣品作為驗證集。并使校正集的含量范圍大于驗證集^[17]，見表2。將校正集和驗證集的NIR光譜與HPLC分析值相關聯(lián)，采用OPUS/QUANT定量分析軟件中的偏最小二乘法建立歐前胡素含量的定量模型。同時，以校正模型相關系數(shù)（R2）、內(nèi)部交叉驗證均方差（RMSECV）和預測均方差（RMSEP）作為模型性能的評價指標。

3 結果與討論

3.1 硫磺熏蒸白芷與非硫磺熏蒸白芷的定性鑒別

3.1.1 光譜預處理及波長范圍選擇 為消除對光譜的各種干擾因素，如高頻隨機噪音、基線漂移、信號本底、樣品不均勻與光散射等，對光譜采用一階導數(shù)+矢量歸一化法進項預處理。NIR光譜的主要吸收區(qū)域為含氫的各級倍頻和合頻帶。12 500.0～9 000.0 cm^-1為二級倍頻區(qū)，此區(qū)域譜線漂移嚴重，強度較弱，為末端效應，系統(tǒng)誤差也會使光譜曲線在末端產(chǎn)生較大噪音，一般不作分析區(qū)域^[18]。從白芷的近紅外光譜可以看出，12 500.0～8 806.0 cm^-1區(qū)段平滑，圖譜信息量較少。8 806.0～5 000.0 cm^-1區(qū)段具有比較豐富的信息，而5 000.0～3 811.0 cm^-1區(qū)段的信息尤為豐富。為了獲得比較全面的圖譜信息，避免高頻隨機噪音、基線漂移、信號本底、樣品不均勻與光散射等對光譜的各種干擾，選取8 806.0～3 811.0 cm^-1的光譜區(qū)段作為近紅外光譜分析的波數(shù)范圍，分析結果準確可靠。

3.1.2 聚類分析 分別將原始光譜圖按照無任何預處理、21點平滑后進行一階導數(shù)求導、21點平滑后進行二階導數(shù)求導、矢量歸一化法、21點平滑后一階導數(shù)求導+矢量歸一化法、21點平滑后二階導數(shù)求導+矢量歸一化法的方法進行預處理，在8 806.0～3 811.0 cm^-1由Ward′s Algorithm法得到的聚類分析結果顯示，21點平滑后一階導數(shù)求導+矢量歸一化法和矢量歸一化法均能將硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸的白芷明顯聚為2類。但是，在光譜信息更為豐富的6 955.0～3 857.0 cm^-1區(qū)段，單純的矢量歸一化法不能有效地聚為2類，而21點平滑后一階導數(shù)求導+矢量歸一化法則能將硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸白芷聚為2類。8 806.0～3 811.0 cm^-1區(qū)段的NIR圖譜經(jīng)21點平滑后一階導數(shù)求導+矢量歸一化法的聚類分析見圖3。硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸的白芷可明顯聚為2類，說明采用NIR光譜技術可以快速、無損地完成硫磺熏蒸白芷和非硫磺熏蒸白芷之間的定性鑒別。曾有文獻報道^[3-4]，白芷經(jīng)硫磺熏蒸后，香豆素類成分的總含量下降了60%～80%。因此，可以認為，NIR聚類分析結果的不同，根本的原因在于硫磺熏蒸對其中化學成分含量的變化，說明NIR的聚類分析結果與化學成分的變化結果具有一致性。

圖3 聚類分析樹狀圖

Fig.3 Dendrogram showing hierachical result

3.2 白芷中歐前胡素定量模型的建立

3.2.1 光譜預處理 由于樣品的物理性質(zhì)，如樣品顏色、顆粒大小等會影響NIR光譜基線的漂移和斜率的變化，對校正模型的建立產(chǎn)生較大的影響，因此對光譜進行預處理是必要的。本實驗以校正模型相關系數(shù)（R2）、內(nèi)部交叉驗證均方差（RMSECV）和預測均方差（RMSEP）作為模型性能的評價指標。其中，R2越接近1，RMSECV越小說明樣品化學值與近紅外預測值相關性越好，且校正模型的結構越合理；RMSEP越小說明模型的預測和推廣性能越好。本實驗采用不同的預處理方法進行比較，見表3，4。從中確定具有最優(yōu)值的最佳預處理方法為一階導數(shù)+減去一條直線法，建模波數(shù)為6 102.2～5 446.3 cm^-1。endprint

3.2.2 主成分數(shù)的選定 使用偏最小二乘法建立定量模型時，主成分數(shù)對模型的穩(wěn)定性影響較大。主成分數(shù)過少導致建模信息不完全，預測精度不夠，主成分數(shù)過多則造成模型過擬合。本實驗采用交叉驗證法考察不同主成分數(shù)對RMSECV值的影響，見圖4?？梢哉J為，本實驗采用的最佳主成分數(shù)以10為宜。

圖4 RMSECV值隨主成分的變化圖

Fig.4 The RMSECV value with different factors

3.2.3 校正模型的建立與驗證 本實驗采用交叉驗證法，校正集22個樣品的NIR光譜經(jīng)一階導數(shù)+減去一條直線法處理后，在6 102.2～5 446.3 cm^-1，選擇前10個主成分建立最優(yōu)校正模型。該校正模型的R2為0.982 8，RMSECV為0.006 8，RMSEP為0.011 8。以預測值與化學值的比值作為預測回收率，計算8個驗證集樣品的平均回收率為100.1%，見表5，圖5。由此可以認為，通過模型獲得的預測值與所謂的化學值具有很大程度的等同性。

圖5 NIR預測值與HPLC化學值的相關圖

Fig.5 Correlation between NIR predicter and HPLC values

4 結論

根據(jù)近紅外光譜數(shù)據(jù)信息，與化學計量學技術相結合，采用聚類分析法可快速直觀地區(qū)分硫磺熏蒸白芷和非硫磺熏蒸白芷，實現(xiàn)兩者的定性鑒別。同時，采用偏最小二乘法建立了白芷中歐前胡素含量的分析方法，根據(jù)驗證集的預測值結果與HPLC測定的化學值的一致性，表明該定量方法準確，預測精度較高。

白芷硫磺熏蒸后，不僅香豆素類成分的含量降低，而且藥效活性下降，影響其臨床療效。近紅外光譜技術結合化學計量學能實現(xiàn)鑒別白芷是否被硫磺熏蒸的快速鑒別，并能根據(jù)定量模型較為準確地進行歐前胡素的含量測定。該方法綠色快速無損，方便實用，將為白芷的質(zhì)量評價提供新的方法和技術。

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