氯吡脲對五味子果實形態(tài)和木脂素的影響

宋新+丁璞+李先寬+陳婷+陳靚+王冰

[摘要]研究了植物生長調(diào)節(jié)劑氯吡脲（CPPU）的1×10-6，0.67×10-6，0.5×10-6清水稀釋液對五味子Schisandra chinensis的果實形態(tài)和有效成分木脂素的影響。結(jié)果表明，CPPU葉面微肥促進了五味子果穗橫徑生長，抑制了果穗縱徑生長。同時，3種不同濃度CPPU清水稀釋液對五味子千粒重，產(chǎn)量均有不同程度的提高，其中0.5×10-6CPPU千粒重，產(chǎn)量最大，1×10-6次之，0.67×10-6提高的最少。通過測定不同采收期CPPU處理的五味子6種木脂素含量表明，木脂素含量的主要積累期在幼果期到半成熟果期，0.67×10-6的氯吡脲清水稀釋液有利于五味子醇乙、五味子丙素、五味子乙素的積累。在五味子臨床需求較大的今天，對CPPU脅迫對五味子的研究應(yīng)予以高度重視。

[關(guān)鍵詞]氯吡脲；五味子；木脂素；果實形態(tài)

氯吡脲[forchlorfenuron，化學(xué)名稱1-（2-氯-4-吡啶）-3′-苯基脲]，簡稱CPPU，是一種植物生長調(diào)節(jié)劑。CPPU在農(nóng)業(yè)方面應(yīng)用較廣，周永豐等^[1]報道了0.1%的氯吡脲是一種理想的甜瓜生產(chǎn)調(diào)節(jié)劑，值得在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，許如意等^[2]報道了0.1%氯吡脲可溶性液劑的濃度為100倍時能促進絲瓜“玉翠”座果，并能增加2個品種的維生素C和可溶性糖的含量，表明氯吡脲是一種較理想的絲瓜生長調(diào)節(jié)劑，可在絲瓜生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，李佳等^[3]對黃瓜消解動態(tài)的研究表明，CPPU在黃瓜中消解較快，黃瓜收獲時（施藥后40 d），樣品中未檢出CPPU殘留，Kobayashi^[4]檢測了63種蔬菜和19種水果發(fā)現(xiàn)，沒有一種農(nóng)作物被檢測出CPPU。

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turez. ） Baill. 的干燥成熟果實，味酸、辛、微苦，功效收斂固澀，益氣生津，補腎寧心^[5]。五味子中含有的多種木脂素成分被認為是五味子最主要的藥理活性成分，具有保肝^[6]、抑制中樞系統(tǒng)^[7]、抗腫瘤^[8]、抗炎^[9]、抗氧化^[10]等藥理作用，其中經(jīng)人工合成提煉的有效成分五味子丙素經(jīng)人工合成提煉而成“聯(lián)苯雙酯”已在臨床應(yīng)用于治療肝炎。關(guān)于CPPU對五味子果實形態(tài)、千粒重、產(chǎn)量、木脂素含量的影響未見報道。

本研究以遼寧中醫(yī)藥大學(xué)五味子試驗田五味子為材料，進行氯吡脲多水平試驗，通過測定五味子果實形態(tài)指標和6種木脂素含量的測定，揭示氯吡脲水稀釋液葉面噴施處理對五味子形態(tài)、產(chǎn)量、各個木脂素不同采收期含量的影響，以期為進一步闡述氯吡脲對五味子品質(zhì)的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1材料

氯吡脲脅迫試驗于2012年5月至12月在遼寧省蓋州市高屯鎮(zhèn)高屯村五味子試驗田進行，該地區(qū)氣候類型為暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，平均海拔82 m，北緯40°26′19.2″，東經(jīng)122°36′17.6″，年平均氣溫8.8 ℃，平均有效積溫3 743.6 ℃，總降水量528.8 mm，初霜10月22日，終霜4月16日，土壤質(zhì)地為壤土，土壤中銨態(tài)氮17 mg·kg^{-1，速效鉀159 mg·kg-1，速效磷57 mg·kg-1，排灌方便。選擇長勢較一致的四年生五味子進行脅迫試驗。試驗材料為五味子的果實，采集時間為6月到11月底，自然陰干，粉碎。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，共設(shè)4個處理，處理1為空白組清水處理組，處理2為氯吡脲1×10-6處理組，處理3為氯吡脲0.67×10-6處理組，處理4為氯吡脲0.5×10-6處理組。各處理組于2012年5月23日進行葉面噴施，噴施時，主要細致地噴于葉子的背面，要先上后下，先里后外，噴至有滴液為止。分別于噴施后的13，83，126，147，184 d即2012年6月5日，2012年8月16日，2012年9月29日，2012年10月20日，2012年11月27日采集五味子果實作為樣品進行木脂素含量測定。}

儀器：Agilent 1100 型高效液相色譜儀（Agilent 公司） ，KQ-250型超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司），電子天平（瑞士 Mettler Toledo AG285、AE240），粉碎機（屹立牌），SL-2D型土壤養(yǎng)分測試儀（北京順龍科技發(fā)展有限公司）；游標卡尺；電子稱（SF-400A）；GPS。

試劑：氯吡脲為四川省蘭月科技開發(fā)有限公司好得美0.1%氯吡脲；對照品五味子醇甲（110857-200507）、五味子甲素（110764-200609）、五味子乙素（110765-200710）、五味子酯甲（111529-200503）（購自中國食品藥品檢定研究院）、五味子醇乙、五味子丙素（購自成都思科華生物技術(shù)有限公司），供含量測定用；甲醇為分析純和色譜純、乙腈為色譜純，水為重蒸餾水。

2方法

2.1五味子果實指標的測定

分別在噴施后的18，38，85 d即2012年6月11日，2012年7月1日，2012年8月17日，用游標卡尺測量同等高度光照強度近似的五味子果穗的橫徑和縱徑的大小，共測量3次。分別在噴施后113 d，即2012年9月16日，采同等高度同等光照的五味子果穗10～15穗，用電子稱對果實稱重，計算千粒重；采收各處理組三分之一果實，用便攜式電子稱稱量，估算產(chǎn)量。

2.2五味子6種木脂素成分的測定

2.2.1 色譜條件 采用Agilent TC- C18 （4.6 mm ×250 mm，5 μm） 色譜柱，流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～17 min，50% A；17～25 min，50%～55% A；25～32 min，55%～75% A； 32～37 min，75%～70%A；37～42 min，70%～65% A；42～47 min，65%～50% A），流速 1.0 mL·min^{-1，檢測波長 217 nm，柱溫 30 ℃，進樣量 10 μL，HPLC圖見圖1。}

2.2.2 溶液的制備對照品溶液 分別稱取對照品五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素適量，精密稱定，色譜甲醇超聲溶解，補足失重，并定容至25 mL量瓶中，經(jīng)過0.45 μm的微孔濾膜，依次得到質(zhì)量濃度分別為0.205 2，0.209 2，0.213 2，0.197 6，0.203 6，0.202 8 g·L^{-1的對照品溶液，備用。再分別精密吸取五味子醇甲400 μL、五味子醇乙100 μL、五味子酯甲100 μL、五味子甲素100 μL、五味子乙素200 μL、五味子丙素20 μL，置于1.5 mL EP管中，加甲醇80 μL混合均勻成混合對照品，備用。}

2.2.3 供試品溶液 取干燥后的五味子果實粉末（干燥至恒重，50 目）約0.25 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，精密加入甲醇23 mL，30 ℃超聲30 min，取出，冷卻至室溫，加甲醇定容至刻度線，搖勻，0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)處理采用Excel和SPSS 19.0，并使用SPSS 19.0進行方差分析，差異顯著性檢驗采用LSD法進行多重比較。

3結(jié)果

3.1氯吡脲葉面微肥的不同處理對不同發(fā)育時間五味子果實的縱、橫徑變化特征

五味子果穗縱橫徑不同時期的差值，即凈生長量的變化可以看出，CPPU處理組的五味子橫徑的生長量大于空白處理組，根據(jù)8月17日和6月11日的縱橫徑變化得出，五味子經(jīng)CPPU處理后的綜合作用是，促進了果穗橫徑的生長，抑制了果穗縱徑的生長，說明CPPU葉面微肥對五味子果穗生長具有調(diào)節(jié)作用，即對果穗橫徑生長的促進，可能是由于對縱徑生長的抑制引起的，見表1。

3.2氯吡脲葉面微肥的不同處理對五味子千粒重和產(chǎn)量的影響

經(jīng)CPPU處理的五味子果實的千粒重都較空白組大，這說明經(jīng)CPPU處理的五味子在促進橫徑增長的同時，也促進了果實的質(zhì)量，經(jīng)CPPU清水稀釋液處理的五味子的產(chǎn)量極顯著高于空白組五味子。統(tǒng)計分析，處理間差異極顯著，進一步進行多重比較，CPPU3種清水稀釋液與對照之間差異都極顯著。對產(chǎn)量性狀進行分析，氯吡脲脅迫的果實千粒重都較對照高，產(chǎn)量的增加部分來源于單個果實的質(zhì)量，見表2。

3.3不同氯吡脲脅迫對五味子果實6種木脂素類成分積累的影響

3.3.1 氯吡脲脅迫下五味子醇甲含量的影響 五味子醇甲含量見圖2，6月5日五味子醇甲的含量較其他采收時間含量都低，五味子醇甲質(zhì)量分數(shù)最高為7.213 mg·g^{-1，是含量最低的12.95倍，這說明五味子醇甲含量的積累主要在6月5日到8月16日。}

3.3.2 氯吡脲脅迫下五味子醇乙的含量 不同CPPU脅迫下，不同時期五味子中五味子醇乙含量差異較大，見圖2。6月5日五味子醇乙的含量較9月29日，10月20日、11月27日低，差異顯著，與8月16日差異不顯著；8月16日較9月29日五味子醇乙含量低，差異極顯著，與其他采收期之間差異都不顯著；10月20日、11月27日與08月16日、9月29日之間五味子差異都不顯著。可見，五味子醇乙含量快速積累期在6月5日到8月16日。除9月29日外，處理2全部高于對照和其他處理，可見0.67×10-6的CPPU最有利于五味子醇乙的積累。

3.3.3 氯吡脲脅迫下五味子酯甲的含量 不同CPPU脅迫下，不同時期五味子中五味子酯甲含量差異較大，見圖2。6月5日五味子酯甲較其他采收期五味子酯甲含量都低，6月5日與8月16日五味子醇甲含量差異不顯著，9月29日五味子酯甲含量較6月5日高0.639 mg·g^{-1，差異顯著?？梢?，五味子酯甲含量的積累期在6月5日到9月29日，9月29日之后五味子酯甲的含量基本趨于穩(wěn)定。如圖可以看出不同處理的五味子酯甲的含量時高時低，可見，氯吡脲脅迫對五味子酯甲含量的積累不具規(guī)律性。}

3.3.4 氯吡脲脅迫下五味子甲素的含量 不同CPPU脅迫下，不同時期五味子中五味子甲素含量差異較大，見圖2。6月5日五味子甲素含量較其他采收時間都低，并且差異顯著，其他采收時間五味子甲素含量差異不顯著，五味子甲素含量最高的為11月27日對照組2.076 mg·g^{-1是含量最低的6月5日對照組五味子甲素的45.13倍?？梢?，五味子甲素含量的快速積累期在6月5日到8月16日。除6月5日外，對照高于全部處理，可見，氯吡脲脅迫處理并未促進五味子甲素含量的積累。}

3.3.5 氯吡脲脅迫下五味子乙素的含量 不同CPPU脅迫下，不同時期五味子中五味子乙素含量差異較大，見圖2。6月5日五味子乙素含量較其他采收時間都低，并且差異顯著，五味子乙素質(zhì)量分數(shù)最高的為11月27日空白組3.709 mg·g^{-1，是含量最低的6月5日空白組五味子乙素的9.23倍?？梢?，五味子乙素含量的快速積累期在6月5日到8月16日，8月16日之后五味子乙素的含量基本趨于穩(wěn)定。除11月27日，處理2五味子乙素含量都較其他處理組高，可見，0.67×10-6的氯吡脲清水稀釋液有利于五味子乙素的積累。}

3.3.6 氯吡脲脅迫下五味子丙素的含量 不同CPPU脅迫下，不同時期五味子中五味子丙素含量差異較大，見圖2。五味子丙素的快速積累期在11月27日到8月16日，差異顯著。除8月16日，處理2五味子丙素含量最高，可見，0.67×10-6的氯吡脲清水稀釋液有利于五味子丙素的積累。

4討論

4.1五味子樣品中氯吡脲HPLC的檢測

齊明芳^[12]對甜瓜果實中氯吡脲的殘留分析表明，在開花時施用氯吡脲處理，至花后25 d已完全分解，無殘留影響。本研究采用HPLC法檢測了五味子樣品中氯吡脲的含量殘留，色譜條件為Agilent TC- C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） 色譜柱；流動相甲醇-水60∶40；進樣體積10 μL；流速 1.2 mL·min^{-1；檢測波長 265 nm；柱溫 40 ℃[13]。結(jié)果表明，在幼果時施用氯吡脲處理，無殘留影響。}

4.2氯吡脲脅迫對五味子果實形態(tài)的影響

CPPU對五味子果實形態(tài)的影響表現(xiàn)在抑制其縱徑的增長，促進其橫徑的增長。王英杰等^[14]對CPPU促進巨峰葡萄果粒肥大的機制研究發(fā)現(xiàn)，氯吡脲通過促進細胞的數(shù)量和細胞的體積而使葡萄的果粒膨大，Kurosaki等的研究表明，氯吡脲處理的獼猴桃細胞的大小并沒有變化，果實的增大來源于細胞數(shù)量的增加。本研究結(jié)果顯示，1×10-6，0.67×10-6，0.5 ×10-6CPPU均可以促進五味子的橫向增長，抑制五味子縱向的增長，說明CPPU有可能是通過增大果肉細胞的橫向生長，抑制了果肉細胞的縱向生長引起的，這還需要對CPPU處理的五味子進行進一步的細胞學(xué)觀察來證明。

4.3氯吡脲脅迫對五味子千粒重和畝產(chǎn)量的影響

孫瑞紅等^[15]報道了0.1%氯吡脲處理的葡萄平均單果重增加了0.5～1.06 g，增產(chǎn)效果達20.2%，周永豐等^[1]報道了0.1%氯吡脲可溶性液劑可顯著提高甜瓜坐果率，從而提高甜瓜的產(chǎn)量。本研究結(jié)果表明，0.1%氯吡脲的不同稀釋倍數(shù)的五味子也表現(xiàn)出了千粒重的提高和五味子產(chǎn)量的提高。本研究表現(xiàn)出了0.1%的氯吡脲隨著稀釋倍數(shù)的增高，千粒重和產(chǎn)量增高。

4.4五味子6種木脂素對氯吡脲脅迫的響應(yīng)

本研究采取HPLC對5個不同采收期的1×10-6，1.5×10-6，2×10-6氯吡脲脅迫條件下的五味子6種木脂素含量進行了測定。研究結(jié)果顯示，1.5×10-6氯吡脲脅迫有助于五味子乙素、五味子丙素含量的積累，對其他4種五味子木脂素含量的積累不起促進作用。聯(lián)苯雙酯是用中藥五味子的有效成分五味子丙素經(jīng)人工合成提煉而成^[16-17]，在臨床已廣泛由于治療應(yīng)用于治療肝炎^[18-22]，但是有報道聯(lián)苯雙酯停藥后會有停藥反應(yīng)^[23-25]，本研究得出1.5×10-6氯吡脲能夠促進五味子丙素的積累，這將具有重大的應(yīng)用價值。趙玥等^[26]報道了不同生長期五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的總量在半成熟果期含量最高。本研究中，五味子酯甲含量的積累期主要在6月5日到9月29日，即幼果到成熟果期，之后含量基本穩(wěn)定，而其他5種木脂素五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素含量的積累期主要在6月5日到8月16日，即幼果到半成熟果期，之后含量基本穩(wěn)定。

總而言之，中藥材的有效成分是植物在生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，而次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生主要是植物在逆境條件下為了更好的適應(yīng)生存而形成的特殊保護代謝物質(zhì)，五味子對不同濃度的氯吡脲其果實形態(tài)、千粒重、產(chǎn)量、6種木脂素的含量表現(xiàn)不同的響應(yīng)。本研究結(jié)果表明，氯吡脲對五味子的脅迫應(yīng)引起足夠的重視。

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Effect of forchlorfenuron on fruit morphology and lignans

content of Schisandra chinensis

SONG Xin， DING Pu， LI Xian-kuan， CHEN Ting， CHEN Liang， WANG Bing*

（Liaoning Universtity of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China）

[Abstract] The effect of plant growth regulator forchlorfenuron （CPPU）1×10-6， 0.67×10-6， 0.5×10-6 on fruit morphology and effective components lignans was studied. Those morphologies were the combination of four basic morphological changes. The result showed， diametre were increased and longitudinal diametre of fruits were inhibited by foliage fertilizers including CPPU. At the same time， 1 000-grain weight and yield showed the varying degrees increase under CPPU. The order of the degree was 0.5×10-6>1×10-6>0.67×10-6. Six lignans content of Schisandra chinensis of different harvest time and different CPPU processing groups were determined， the results showed that lignans accumulation occurred mainly in periods of premature the half mature fruiting stages. Under the 0.67×10-6 CPPU treatment， schisandrol B， schisandrin B， schisandrin C content of S. chinensis showed different increase.

[Key words] forchlorfenuron； Schisandra chinensis； lignans； fruit morphology

doi：10.4268/cjcmm20140907endprint