張慶華,王青,尚田田,趙志雨,徐彥召,胡建和

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

牛紅細胞抗菌肽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性

張慶華,王青,尚田田,趙志雨,徐彥召,胡建和

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

通過瓊脂平板法測定了牛紅細胞抗菌肽SP-18對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌活性,以微量肉湯稀釋法測定其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）,并在掃描電鏡（SEM）下觀察其對細菌生物膜的影響.結(jié)果表明：SP-18對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有明顯的抑制活性,MIC分別為1.0 mg/mL、0.25 mg/mL；SEM觀察發(fā)現(xiàn)抗菌肽作用后細菌生物膜發(fā)生皺縮、破裂,金黃色葡萄球菌發(fā)生膜裂解,大腸桿菌表面出現(xiàn)孔洞結(jié)構(gòu).研究表明SP-18具有良好的抗菌活性,并通過破壞細菌生物結(jié)構(gòu)的作用機制發(fā)揮抑菌效果,在抗菌肽未來的開發(fā)應用中具有良好的前景.

紅細胞抗菌肽；抑菌活性；掃描電鏡觀察

近年來,抗生素的濫用造成藥物殘留和細菌耐藥性問題日漸突出,對畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康造成巨大威脅[1].某些抗生素在很多國家已經(jīng)被禁用,致使新型抗菌藥物的研發(fā)變得更為迫切[2].抗菌肽作為生物機體的防御效應因子在自然界中普遍存在,是參與生物體自身免疫的第一道防線[3].抗菌肽在生物體的先天性免疫方面起著重要的作用,如輔助免疫細胞對抗外來抗原、消滅炎癥等[4].目前研究表明,許多天然抗菌肽對臨床常見的耐藥細菌、病毒具有良好的殺滅效果.中科院張云課題組研究發(fā)現(xiàn)：蛇毒抗菌肽OH-CATH30對臨床常見的500多種耐藥細菌具有較強的抑菌效果,對正常哺乳動物細胞毒性及溶血性較低[5].Hood等對蜜蜂蜂毒中提取的一種抗菌肽Melittin研究發(fā)現(xiàn),Melittin可以破壞HIV的外層衣殼蛋白,直接殺滅HIV病毒[6].抗菌肽對病原微生物具有高效、廣譜、作用機制獨特及不易引發(fā)耐藥性等特點,是目前國際公認的抗生素最佳替代品.

牛紅細胞抗菌肽SP-18是本課題組由牛血紅素α-亞基中分離提取的一種線性抗菌肽.本試驗通過活性檢測、掃描電鏡觀察的方法,對SP-18進行活性鑒定分析.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SP-18（上海吉爾生化公司產(chǎn)品）；金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸桿菌ATCC25922為本實驗室保存菌種；氨芐青霉素、胰蛋白胨、MH肉湯培養(yǎng)基、TSB均購自Solarbio公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 試驗儀器

Legend Mach 1.6R高速離心機（美國Thermo Scientific公司）；Varioskan Flash多功能酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；Alpha 1-4LSC真空冷凍干燥儀（德國MARIN CHRIST公司）；Quanta 200FEG環(huán)境掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）.

1.3 試驗方法

1.3.1 抑菌活性及MIC測定配制2 mg/mL的SP-18溶液,瓊脂糖彌散法測定不同溫度下P3的抑菌活性.用TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)測試細菌至對數(shù)生長期,菌懸液離心、洗滌,于平皿內(nèi)加入高壓滅菌的底層培養(yǎng)基,待凝固后打3個孔（孔徑小于2.5 mm）,每孔加入約10 μL SP-18溶液.以10 mg/mL的氨芐青霉素為陽性對照,無菌去離子水為陰性對照.將加樣品后的平皿倒置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi),3 h后倒入覆蓋瓊脂, 37℃過夜培養(yǎng),觀察結(jié)果.

微量肉湯稀釋法測定抗菌肽對測試菌株的MIC.TSB液體培養(yǎng)基過夜擴大培養(yǎng)測試細菌,隨后在600 nm處測定OD值（0.6～0.8）,6 000 r/min,離心10 min,棄上清,等量0.01 mol/L PBS重懸細菌.用MH肉湯培養(yǎng)基將待測細菌稀釋到2×106CFU/mL.去離子水倍比稀釋抗菌肽溶液（2 mg/mL～31.25 μg/mL）.于細胞培養(yǎng)板,每孔添加50 μL血紅蛋白抗菌肽稀釋液和50 μL稀釋菌液,每個濃度3個重復,37℃培養(yǎng)16～20 h,以小孔內(nèi)細菌完全不生長的濃度即為SP-18最小抑菌濃度.

1.3.2 掃描電鏡觀察培養(yǎng)至對數(shù)生長期的正常細菌及添加抗菌肽孵育后的菌懸液各5 mL,3 000 r/min,離心5 min,PBS溶液洗滌沉淀細菌2次,棄上清.體積分數(shù)為2.5%的戊二醛溶液5 mL,重懸菌液,固定3 h以上,滴加細菌固定液于8 mm圓形蓋玻片上,4℃下自然沉淀1 h,將蓋玻片分別放置于體積分數(shù)為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液中梯度脫水20 min,100%乙醇2次.真空冷凍干燥儀干燥樣品6 h后,經(jīng)離子濺射儀噴金,于掃描電鏡下觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性及MIC

不同濃度SP-18作用下金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長情況見表1.

表1 不同濃度下細菌生長情況Tab.1 The growth of bacteria in different concentration of hemoglobin antimicrobial peptide

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌瓊脂平板試驗結(jié)果顯示,牛紅細胞抗菌肽的樣品孔周圍均出現(xiàn)明顯的抑菌圈,大腸桿菌平板抗菌肽抑菌圈直徑大于金黃色葡萄球菌平板抑菌圈直徑.微量肉湯稀釋法MIC測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SP-18對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為1 mg/mL、0.25 mg/mL.

2.2 掃描電鏡觀察結(jié)果

正常培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及其經(jīng)過抗菌肽作用后的細菌形態(tài)掃描電鏡觀察結(jié)果如圖1所示.

圖1 不同細菌形態(tài)的觀察Fig.1 Observation of the morphology of tested bacteria

掃描電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌排列呈葡萄串狀（圖1-A）,個體大小均勻,近似圓形,表面光滑,無鞭毛、芽孢.抗菌肽作用后金黃色葡萄球菌發(fā)生團狀聚集（圖1-C）,細菌大小變化不一,細胞膜發(fā)生皺縮、破裂.正常培養(yǎng)的大腸桿菌呈兩端鈍圓、無芽孢的短桿菌,細菌形態(tài)飽滿、表面光滑（圖1-B）.抗菌肽作用后的大腸桿菌表面發(fā)生凹陷、皺褶,細菌膜表面出現(xiàn)孔洞樣結(jié)構(gòu)（圖1-D）.

3 討論

2010年攜帶NDM-1基因的“超級細菌”出現(xiàn)并在全球范圍內(nèi)快速傳播,對臨床常用抗生素具有極強的抵抗能力,人們幾乎無藥可用[7-8].傳統(tǒng)抗生素進入細胞內(nèi)部,通過擾亂或阻斷其正常的生長代謝途徑發(fā)揮抑菌效果.而細菌在長期的進化過程中通過基因突變、改變藥物靶位結(jié)構(gòu)、自身合成抗生素降解酶或修飾酶等方式能躲避多種抗生素[9].而耐藥基因在細菌之間的相互傳播,造成細菌廣泛性耐藥問題.

抗菌肽主要是通過電荷吸引作用吸附于細菌細胞膜表面,使細胞膜發(fā)生去極化,并形成疏水性低聚物插入細菌膜內(nèi)部,引起細胞內(nèi)容物流失,細胞膜裂解.與傳統(tǒng)抗生素殺菌作用機制不同,抗菌肽是以物理損傷的方式,消滅細菌,理論上細菌無法躲避.通過本試驗,對所分離的紅細胞抗菌肽抑菌活性進行了初步的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：紅細胞抗菌肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌表現(xiàn)良好的抑菌活性,造成細菌細胞膜發(fā)生明顯的皺縮、裂解,從而發(fā)揮抑菌活性.

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[3]Hancock R E,Lehrer R.Cationic peptides：a new source of antibiotics[J].Trends in Biotechnology,1998,16（2）：82-88.

[4]Lai Y P,Gallo R L.AMPed up immunity：how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense[J].Trends in Immunology,2009,30（3）：131-141.

[5]Li S A,Lee W H,Zhang Y.Efficacy of OH-CATH30 and its analogs against drug-resistant bacteria in vitro and in mouse models[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2012,56（6）：3309-3317.

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（責任編輯：鄧天福）

Inhibition of the antibacterial activity of bovine red blood cell antimicrobial peptide to Staphylococcus aureus and Escherichia coli

Zhang Qinghua,Wang Qing,Shang Tiantian,Zhao Zhiyu,Xu Yanzhao,Hu Jianhe
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

The bioactivity of novel bovine red blood cell antimicrobial peptide SP-18 to Staphylococcus aureus, Escherichia coli was tested by agar gel diffusion method in this paper.The minimal inhibitory concentration of bovine red blood cell antimicrobial peptide to S.aureus,E.coli was tested by broth micro-dilution method.The morphology of bacterias was observed by scanning electron microscope.The results showed that SP-18 have inhibitory action to tested bacteria,the MIC to S.aureus and E.coli were 1.0 mg/mL and 0.25 mg/mL,respectively.The cell membrane of tested bacteria were observed shrinking,distorting.The cell membrane of S.aureus was cracked.The surface of E.coil has many holes.These results indicated red blood cell antimicrobial peptide restrained the bacteria by damaging its cell membrane,which had a potential advantage in the development and application.

redbloodcell antimicrobial peptide；antibacterial activity；observation withscanningelectron microscope

S859.79+7

A

1008-7516（2014）02-0035-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.02.009

2014-03-12

國家自然科學基金（31372469）

張慶華（1988-）,男,河南開封人,碩士研究生.主要從事動物微生物學研究.

徐彥召（1984-）,男,河南許昌人,講師.主要從事動物微生物學、免疫學研究.胡建和（1968-）,男,河南輝縣人,教授,碩士生導師.主要從事動物微生物學研究.