陳海娟 胡瑞鴻 吳 瓊 孫 心

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

禽流感H5N1亞型不同株抗原抗體相互檢測相關(guān)性試驗(yàn)

陳海娟 胡瑞鴻 吳 瓊 孫 心

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）是禽流行性感冒（簡稱禽流感，Avian Influenza，AI）的病原。其中高致病性的H5N1亞型AIV可以造成雞群的大批死亡，對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)影響嚴(yán)重，并可引起人的感染和死亡。通過接種疫苗能有效地控制禽流感的傳播，在禽流感疫苗免疫效力的評(píng)價(jià)過程中，監(jiān)測免疫雞血清抗體是最常用、最可行的方法。

2009年農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-5株）和重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）制造，2012年重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）及重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗（H5N1，Re-6株+Re-4株）取代以上兩個(gè)產(chǎn)品，2014年，北方出現(xiàn)了新的7.2分支毒株，而禽流感Re-4株疫苗和Re-6株疫苗對(duì)這種新型流行株的保護(hù)效力并不佳。2014年4月11日，農(nóng)業(yè)部發(fā)布“中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告 第2093號(hào)”，制定了重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-7株）和重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗（Re-6株+Re-7株）2種獸藥產(chǎn)品制造及檢驗(yàn)規(guī)程，全國將主要以Re-6與Re-7兩種疫苗聯(lián)合免疫為新的趨勢(shì)。

本試驗(yàn)分別用不同毒株的禽流感試驗(yàn)抗原與不同毒株禽流感疫苗免疫雞的血清通過HI試驗(yàn)相互檢測，對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行分析，從而得出不同毒株的相關(guān)性。

重組禽流感滅活疫苗；不同株；相關(guān)性

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)抗原

禽流感試驗(yàn)抗原和陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，分別為：

禽流感血凝試驗(yàn)抗原（H5亞型，Re-4株）2012001批

禽流感血凝試驗(yàn)陽性血清（H5亞型，Re-4株）201201批

禽流感血凝試驗(yàn)抗原（H5亞型，Re-5株）2012001批

禽流感血凝試驗(yàn)陽性血清（H5亞型，Re-5株）201201批

禽流感血凝試驗(yàn)抗原（H5亞型，Re-6株）2012001批2013003批

禽流感血凝試驗(yàn)陽性血清（H5亞型，Re-6株）201201批201301批

禽流感血凝試驗(yàn)抗原（H5亞型，Re-7株）2014001批

禽流感血凝試驗(yàn)陽性血清（H5亞型，Re-7株）2014001批

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

21～28日齡SPF雞，由北京梅里亞家禽有限公司提供SPF種蛋，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司自行孵化出雛飼養(yǎng)至日齡。

1.3 試驗(yàn)疫苗

由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)，分別為：

重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-5株）201210～201212批

重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株） 201220～201222批

重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）201204～201206批

重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗（Re-6 株+Re-4 株）201204～201206批 201432～201434批

重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗（Re-6 株+Re-7 株）201401～201403批

2 試驗(yàn)方法

2.1 不同株相互檢測

分別用Re-6株禽流感血凝試驗(yàn)抗原檢測Re-5株、Re-5株+Re-4株禽流感免疫雞血清；用Re-5株禽流感血凝試驗(yàn)抗原檢測Re-6株、Re-6株+Re-4株禽流感免疫雞血清；用Re-7株禽流感血凝試驗(yàn)抗原檢測Re-6株+Re-4株禽流感免疫雞血清；用Re-4株禽流感血凝試驗(yàn)抗原檢測Re-6+Re-7株禽流感免疫雞血清

2.2 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）

將稀釋完的96孔V型微量血凝板，每一稀釋度分別加入25μlPBS，再加入1%雞紅細(xì)胞懸液25μl。對(duì)照孔是50μlPBS加入25μl1%雞紅細(xì)胞懸液。

在微量振蕩器振蕩30s左右，室溫（20～25℃）靜置30～40min，判定結(jié)果。

將血凝板傾斜70°且靜置10s左右開始記錄，對(duì)照孔紅細(xì)胞成明顯的鈕扣狀沉到孔底。凡反應(yīng)孔底部有紅細(xì)胞沉積且沿傾斜面向下呈淚珠狀流淌，呈現(xiàn)與紅細(xì)胞對(duì)照孔一樣者為完全不凝集孔（—）；反應(yīng)孔底部有紅細(xì)胞沉積且沿傾斜面緩慢向下呈淚珠狀流淌者為不完全凝集孔（+）；反應(yīng)孔底部有紅細(xì)胞沉積但不沿傾斜面流淌者為50%凝集孔（++）；除底部有少許紅細(xì)胞外，反應(yīng)孔其他部位幾乎為完全凝集孔（+++）；反應(yīng)孔底部無紅細(xì)胞，整個(gè)反應(yīng)孔完全凝集者為完全凝集孔（＃）。

2.3 4HAU抗原工作液的配制及檢驗(yàn)

以2.2標(biāo)定的抗原完全凝集孔對(duì)應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)為該抗原的血凝效價(jià)，除以4得到4HAU抗原的最終稀釋倍數(shù)，再進(jìn)行4HAU抗原的校對(duì)。將配制的4HAU抗原用PBS進(jìn)行1：2、1：3、1：4、1：5、1：6和1：7稀釋。

取96孔V型微量血凝板，每一稀釋度分別取25μl加入到孔中，加入PBS25μl，再加入1%雞紅細(xì)胞懸液25μl。對(duì)照為50μlPBS+25μl1%雞紅細(xì)胞懸液。

以上試驗(yàn)做2個(gè)平行重復(fù)。

在微量振蕩器振蕩30s左右。室溫靜置30～40min，判定結(jié)果。

表6 用Re-4株試驗(yàn)抗原檢測Re-6株+Re-7株血清（201401-201403 Re-6株+Re-7株滅活苗）

如果配制的抗原工作液為4HAU，則1：4稀釋度完全凝集（＃）；如果4HAU高于4個(gè)單位，可能1：5或1：6為完全凝集；

表1 用Re-6株試驗(yàn)抗原檢測Re-5株血清（201210-201212Re-5株滅活苗）

表2 用Re-6株試驗(yàn)抗原檢測Re-5株+Re-4株血清（201220-201222 Re-5株+Re-4株滅活苗）

表3 用Re-5株試驗(yàn)抗原檢測Re-6株血清（201204-201206 Re-6株滅活苗）

表4 用Re-5株試驗(yàn)抗原檢測Re-6株+Re-4血清（201204-201206 Re-6株+Re-4滅活苗）

表5 用Re-7株試驗(yàn)抗原檢測Re-6株+Re-4株血清（201432-201434 Re-6株+Re-4株滅活苗）

如果較低，則可能1：2或1：3為完全凝集。應(yīng)根據(jù)測定結(jié)果適當(dāng)調(diào)整，使抗原工作液確為4HAU。

2.4 血凝抑制試驗(yàn)（HI）

取96孔V型微量血凝板，第1～11孔加入25μlPBS，第12孔加入50μlPBS。隨后第1孔加25μl血清，反復(fù)吹吸3～5次混勻，從第1孔吸取25μl血清加入第2孔，混勻后吸取25μl加入第3孔，如此進(jìn)行倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25μl棄去。

分別向第1～11孔加入25μl的4HAU抗原工作液，在微量振蕩器振蕩30s左右。室溫靜置30分鐘。

每孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液25μl。在微量振蕩器振蕩30s左右。室溫靜置30～40min，判定結(jié)果。

3 試驗(yàn)結(jié)果

4 試驗(yàn)總結(jié)

（1）禽流感Re-5株血清中含禽流感Re-6株抗體平均相差4.8

（2）禽流感Re-5株+Re-4株血清中含禽流感Re-6株抗體平均相差4.7

（3）禽流感Re-6株血清中含禽流感Re-5株抗體平均相差2.1

（4）禽流感Re-6株+Re-4株血清中含禽流感Re-5株抗體平均相差2.2

（5）禽流感Re-6株+Re-4株血清中含禽流感Re-7株抗體平均相差5.9

（6）禽流感Re-6株+Re-7株血清中含禽流感Re-4株抗體平均相差1.2

5 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明：禽流感Re-6株血清含禽流感Re-5株抗體較高，禽流感Re-7株血清含禽流感Re-4株抗體較高，反之則較低，證明重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）可替代重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-5株），重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-7株）可替代重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-4株）。