連續(xù)中壓PVPP柱層析純化茶多酚及EGCG的研究

高彥華，陳 穎

(東北石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 石油與天然氣化工省重點實驗室，黑龍江 大慶 163318)

茶多酚是從茶葉中提取的多酚類活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、降血脂、防輻射等多種重要的生物活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域。其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶多酚中的主要生物活性成分，是目前科研和產(chǎn)品開發(fā)的熱點[1-5]。因此，茶多酚的提取及EGCG的純化研究已受到廣泛關(guān)注。

作者前期研究[6]表明，采用硅膠進(jìn)行柱層析可以對茶多酚及EGCG的分離取得較理想的效果，柱層析系統(tǒng)中，柱塞泵的驅(qū)動力可大大縮減分離周期，提高分離效率。但是，對環(huán)境造成污染，同時也給混合溶劑的回收帶來困難，操作也比較繁瑣。交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)是一種不溶于水、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及一般有機(jī)溶劑的交聯(lián)聚合物。作為一種重要的高分子精細(xì)化工產(chǎn)品，PVPP是一種無毒、無刺激性、安全穩(wěn)定的聚合物，具有很強(qiáng)的選擇吸附能力，能夠通過羰基與多酚類物質(zhì)形成氫鍵絡(luò)合物[7-8]。因此，作者在前期工作的基礎(chǔ)上，以PVPP為填料，以丙酮為洗脫劑，研究了連續(xù)中壓柱層析對茶多酚及EGCG的分離和純化，取得了令人滿意的效果，縮短了生產(chǎn)周期，克服了敞口常壓柱層析生產(chǎn)周期長,分離效果差,且易逸出有機(jī)溶劑蒸氣污染環(huán)境等不足,減少了對環(huán)境造成的污染，大大降低了生產(chǎn)成本。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

PVPP：分析純，北京中生瑞泰科技有限公司；EGCG等標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于98%，美國Sigma公司；色譜檢測試劑乙腈、乙酸乙酯、硫酸：色譜純，美國DimaTechnology Inc公司；TLC色譜板：硅膠HF254，上海源葉科技有限公司。

連續(xù)不銹鋼中壓層析系統(tǒng)：玻璃層析柱根據(jù)文獻(xiàn)[6]自制，柱長1 500 mm，內(nèi)徑200 mm，耐壓20 MPa；2J-X16/15柱塞式計量溶劑泵：杭州之江科學(xué)儀器廠；層析儀：自制；SHB-IIIG循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；R201D旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器：上海申勝公司；D99型臺式高速微型離心機(jī)：寧波新芝科器研究所；LC-1500高效液相色譜儀：1580泵，UV- 1575紫外檢測器，日本Jasco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取液的制備

茶多酚提取液根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]從新鮮老齡綠茶葉中提取，并經(jīng)過膜分離處理得反滲透膜濃縮的茶多酚提取液。其中w(茶多酚)=41.05%，w(EGCG)=17.16%。

1.2.2 靜態(tài)吸附解吸過程

稱取一定量的PVPP加入適量去離子水充分溶脹后去水[w(水)=12%，下同]，加入茶多酚提取液，常溫下于搖床中充分吸附，加入除雜劑除雜質(zhì)后，加入洗脫劑洗脫，濃縮得濃縮液。取樣，離心分離，檢測w(EGCG)。

1.2.3 動態(tài)吸附解吸過程

1.2.3.1 層析柱裝填

稱取一定量溶脹后PVPP(以絕干質(zhì)量計，下同)于層析柱內(nèi)，使PVPP均勻填滿整個柱體不留死體積，用砂芯板和法蘭封口，將層析柱安裝至層析儀上，氮氣加壓，用柱塞泵泵入洗脫液以一定流速淋洗直至柱平衡。

1.2.3.2 動態(tài)吸附解吸條件的確定

室溫下泵入茶多酚提取液，以一定流速通過層析柱，進(jìn)行動態(tài)吸附實驗，測定流出液中w(EGCG)，繪制出PVPP的動態(tài)吸附曲線。同時，考察洗脫流速對PVPP解吸性能的影響，確定最佳的解吸條件。

1.2.3.3 柱層析純化過程

稱取一定量的茶多酚提取液，用柱塞式溶劑泵進(jìn)液，除雜劑除雜質(zhì)后，洗脫液洗脫，洗脫液分段收集，TLC及HPLC檢測，合并，減壓濃縮回收洗脫液。低純度組分收集后作為層析原料再次純化。有效成分經(jīng)檢測全部流出后，層析柱經(jīng)再生處理后可再次上樣，反復(fù)使用。

1.2.4 w(茶多酚)、w(EGCG)及w(咖啡因)的分析方法

w(茶多酚)測定采用GB8313—87分析檢測；w(EGCG)采用文獻(xiàn)[7]提供的高效液相色譜法(HPLC)分析；w(咖啡因)采用GB8312—87分析檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜態(tài)吸附結(jié)果

2.1.1 m(PVPP)對吸附效果的影響

稱取1～8 g PVPP，分別加入150 mL茶多酚提取液[ρ(EGCG)=10.01 mg/mL，下同]，于搖床中充分吸附，考察m(PVPP)對吸附效果的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，m(PVPP)越大，EGCG吸附率越大。但當(dāng)m(PVPP)>6 g時，EGCG吸附率增大不明顯，考慮到經(jīng)濟(jì)因素以及方便后處理，確定PVPP最佳用量為6 g，即每克PVPP吸附EGCG0.25 g。

m(PVPP)/g圖1 m(PVPP)對吸附效果的影響

2.1.2 PVPP靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

稱取6 g PVPP加入150 mL茶多酚提取液，于搖床中進(jìn)行吸附60 min。每10 min取樣檢測，PVPP對EGCG的吸附動力學(xué)曲線見圖2。

t/min圖2 PVPP的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

由圖2可知，隨吸附時間的增加，EGCG吸附率逐漸增加，但當(dāng)吸附時間超過30 min后，其EGCG吸附率增加不明顯，因此，確定最佳的吸附時間為30 min。實踐證明，較短的平衡時間為PVPP的工業(yè)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。其吸附前后萃取液HPLC譜圖對比見圖3和圖4。

t/min圖3 吸附前溶液高效液相色譜圖

t/min圖4 吸附后溶液高效液相色譜圖

由圖3、圖4對比分析可知，EGCG能夠有效地被吸附，咖啡因吸附少量，大部分殘留在吸附后的溶液中而被除去。因此，選用PVPP吸附，效果較理想。

2.1.3 EGCG的吸附等溫線的測定

稱取6 g PVPP 5份，分別加入150 mL茶多酚提取液于搖床中吸附30 min，考察不同溫度的吸附效果，結(jié)果見圖5。

t/℃ 圖5 EGCG的吸附等溫線

由圖5可知，PVPP對EGCG的吸附效果隨溫度的升高雖表現(xiàn)為先增大后減少的趨勢，但相對較緩慢。分析其原因為當(dāng)溫度升高，一方面分子熱運(yùn)動加快，增加了PVPP與EGCG分子間的碰撞幾率，有利于吸附反應(yīng)的進(jìn)行。同時高溫有利于解吸反應(yīng)，不利于吸附反應(yīng)，因此也使EGCG吸附率下降。2種因素的結(jié)合效果說明，當(dāng)溫度在25～45 ℃，吸附速率的增大速度比解吸速率的增大速度快，EGCG的吸附率增大。當(dāng)溫度高于45 ℃時，解吸速率增大速度比吸附速率的增大速度快，EGCG的吸附率下降。從圖5顯示的結(jié)果也可以看出，當(dāng)溫度25～45 ℃時，吸附率增加不明顯，考慮到節(jié)省能耗因素，采用常溫條件作為PVPP與EGCG吸附的溫度。

2.1.4 除雜劑的篩選

考慮到待分離的提取液中含有較多的色素、咖啡因、糖類、蛋白以及其它極性大的雜質(zhì)，首先選擇了常用的經(jīng)濟(jì)適用且綠色無污染的去離子水。另外考慮了極性較大的不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇及丙酮，通過HPLC跟蹤檢測發(fā)現(xiàn)，低體積分?jǐn)?shù)的上述3種溶劑雖可不同程度除去雜質(zhì)，但在后續(xù)的EGCG洗脫過程中即使選用高濃度甲醇和乙醇這2種溶劑，EGCG洗脫率均較低，而考慮到后續(xù)過程不宜再增加新溶劑，盡量選擇同一類除雜劑及洗脫劑，選擇了低體積分?jǐn)?shù)丙酮進(jìn)一步除雜。

取6 g按上述最佳吸附條件吸附后的PVPP，加入120 mL去水離子水水洗，水洗液HPLC譜圖見圖6，加入φ(丙酮)=10%丙酮溶液250 mL洗脫，洗脫液HPLC譜圖見圖7。

t/min圖6 水洗液高效液相色譜圖

t/min圖7 φ(丙酮)=10%洗脫液高效液相色譜圖

由圖6可知，水洗能夠?qū)⑽皆赑VPP上的色素、咖啡因、糖類以及蛋白等雜質(zhì)部分除去，同時還將溶于水的極性較大的雜質(zhì)部分除去。由圖7可知，φ(丙酮)=10%的丙酮溶液不僅能夠?qū)⑺次赐耆サ目Х纫虺?，而且能夠?qū)⒁徊糠謽O性較大的雜質(zhì)、色素部分除去，達(dá)到進(jìn)一步純化的目的。

2.1.5 洗脫液體積分?jǐn)?shù)的確定

稱取32 g PVPP分成4等份，按上述方法吸附以及除雜后，向每份內(nèi)分別加入不同丙酮溶液各600 mL進(jìn)行洗脫，洗脫液離心，減壓濃縮，浸膏干燥至質(zhì)量恒定，HPLC檢測，計算EGCG回收率及質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖8。

φ(丙酮)/%圖8 不同φ(丙酮)洗脫效果對比

由圖8可知，不同φ(丙酮)對EGCG的洗脫率是不同的，其中φ(丙酮)=90%時丙酮洗脫回收率最高為86.21%。從質(zhì)量分?jǐn)?shù)來看，4種體積分?jǐn)?shù)的洗脫劑洗脫產(chǎn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)相仿，均約為53%，因此，在保證w(EGCG)相差不多的情況下，盡量選擇洗脫EGCG總量多的φ(丙酮)，因此確定最佳洗脫劑為φ(丙酮)=90%。

2.2 動態(tài)吸附解吸附條件的確定

將提取液分別控制不同流速進(jìn)行動態(tài)吸附，確定最佳上樣流速；再用水、φ(丙酮)=10%丙酮溶液以及φ(丙酮)=90%丙酮溶液分別采用不同流速連續(xù)通過層析柱洗脫，計算出回收率，然后以流速為橫坐標(biāo)、吸附率和回收率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖9。

流速/(mL·min-1)圖9 不同流速對EGCG的吸附率及回收率的影響

由圖9可以看出，隨著流速的增加，PVPP對EGCG的吸附率及回收率均有所降低，流速越低吸附率和回收率越高，但流速過低將導(dǎo)致吸附解吸過程周期過長，因此建議以30 mL/min流速為好。

2.3 柱層析純化結(jié)果

按照靜態(tài)吸附所確定的最佳吸附及解吸條件進(jìn)行放大實驗，按要求分別調(diào)配好φ(丙酮)=10%丙酮除雜液以及φ(丙酮)=90%洗脫液于溶劑瓶中，w(NaOH)=4%的PVPP再生液裝于再生液溶劑瓶中。稱取60 g PVPP于中壓柱內(nèi)，用柱塞式溶劑泵泵入φ(丙酮)=90%平衡層析柱，泵入1 500 mL茶多酚提取液后，經(jīng)1 200 mL去水離子水水洗，2 500 mLφ(丙酮)=10%溶液除雜，再泵入5 000 mLφ(丙酮)=90%洗脫液洗脫，洗脫液分段收集，每份100 mL，用薄層層析及HPLC跟蹤分析檢測，合并，減壓濃縮回收洗脫液。濃縮液再經(jīng)乙酸乙酯萃取后，真空干燥得產(chǎn)品。低純度組分收集后作為層析原料再次純化。

經(jīng)上述柱層析純化后，可制備w(茶多酚)>98%，w(咖啡因)<1%，w(EGCG)=60.12%的產(chǎn)品，EGCG回收率為85.25%。

2.4 PVPP的再生

由于PVPP是一種價格昂貴的高分子精細(xì)化學(xué)品，而良好的重復(fù)使用性能則將會大大降低生產(chǎn)成本。為此通過對吸附-解吸后的PVPP再生處理，研究其再生性能。再生方法為將使用過的PVPP用去離子水沖洗后，用w(NaOH)=4%的溶液浸泡24 h，過濾后再用去離子水沖洗干凈即可。實驗表明，再生PVPP的收率達(dá)到95%以上，再生PVPP對EGCG的吸附性能在重復(fù)使用5次以上，PVPP的吸附性能無明顯降低，結(jié)果見表1。由表1可見，PVPP具有較好的重復(fù)使用性能。

表1 PVPP再生性實驗結(jié)果1)

1) 再生PVPP處理量為6 g。

3 結(jié) 論

以PVPP為填料，丙酮為洗脫劑，研究了連續(xù)中壓柱層析對茶多酚及EGCG的分離和純化，實驗得到的主要結(jié)論如下。

(1) PVPP靜態(tài)吸附研究表明，PVPP最佳用量為每克PVPP吸附EGCG0.25 g，常溫吸附，吸附時間30 min；除雜劑為去離子水以及φ(丙酮)=10%丙酮溶液，最佳洗脫劑為φ(丙酮)=90%丙酮溶液。

(2) 連續(xù)中壓柱層析分離最佳工藝條件為1 500 mm ×200 mm的自制不銹鋼中壓層析柱，流速為30 mL/min，經(jīng)PVPP充分吸附后，去離子水和φ(丙酮)=10%丙酮除雜后，用φ(丙酮)=90%丙酮洗脫，洗脫液回收溶劑后，經(jīng)乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)濃縮、真空干燥后可將w(EGCG)提高至60.12%，回收率為85.25%。w(茶多酚)>98%，w(咖啡因)<1%。

(3) 采用丙酮進(jìn)行除雜及洗脫，使溶劑的回收更加方便快捷，避免了環(huán)境污染。

(4) PVPP具有較好的再生重復(fù)使用性，大大降低了生產(chǎn)成本。

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