酶育牛黃的小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)研究*

邵明珠 魏寅翼 劉化俠

(1.泰山醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，山東 泰安 271016；2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250012)

天然牛黃由于資源奇缺，價(jià)格昂貴，而臨床需求量大，開發(fā)牛黃代用品成為一種趨勢(shì)。泰山醫(yī)學(xué)院自行研制的酶育牛黃(calculus bovis cultivated by glucuronidase，CBCG)[1，2]。實(shí)驗(yàn)研究證明，CBCG生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，其膽紅素含量，指紋圖譜和膽酸類成分與天然牛黃類似[3-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，CBCG具有鎮(zhèn)靜、抗炎以及抗腫瘤作用[6，7]。但是其安全性有待研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)灌胃給藥的方法，觀察酶育牛黃的安全性，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠36只，雌雄各半，體重20±2 g，清潔級(jí)，由泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)：scxk(魯)2005 0015。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24 ℃，濕度45%～60%，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。小鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，由泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)用藥 CBCG，泰山醫(yī)學(xué)院提供。CBCG淀粉混懸液的制備：將適量CBCG加入1%淀粉液中攪拌均勻制備不同濃度的CBCG淀粉混懸液。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1預(yù)實(shí)驗(yàn) 選取昆明種小鼠16只，雌雄各半，體重20±2 g。隨機(jī)分為兩組，每組8只。給藥前禁食不禁水12 h。給予CBCG淀粉混懸液2 g/kg，0.2 ml/10g或是5 g/kg，0.4 ml/10 g，24 h內(nèi)灌胃3次。常規(guī)飼養(yǎng)，灌胃后密切觀察小鼠4 h，之后改為每天上午、下午各觀察小鼠1次，連續(xù)觀察14天。觀察記錄小鼠的行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、進(jìn)食量、排泄、皮毛，體質(zhì)量變化以及死亡等情況。兩組小鼠14天之內(nèi)均未見死亡及異常反應(yīng)，處死后解剖肉眼觀察小鼠主要臟器，心、肝、脾、腎、胃、腸等均未發(fā)現(xiàn)明顯異常改變。CBCG可供灌胃的最大濃度可達(dá)0.125 g/ml，所以5 g/kg，0.4 ml/10g已達(dá)CBCG灌胃的最大濃度和最大體積，預(yù)實(shí)驗(yàn)小鼠全部存活，無(wú)法測(cè)出該藥物的半數(shù)致死劑量(LD50)。參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[8]，將用藥量調(diào)整為5g/kg，0.4ml/10g進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.3.2正式實(shí)驗(yàn) 選昆明種小鼠20只，雌雄各半，體重20±2 g，隨機(jī)分為給藥組和對(duì)照組(10只/組)。給藥前禁食不禁水12 h。給藥組給予CBCG淀粉混懸液5 g/kg，0.4 ml/10 g，對(duì)照組給予1%淀粉液灌胃，0.4 ml/10 g，24 h內(nèi)灌胃3次。常規(guī)飼養(yǎng)，灌胃后密切觀察小鼠4 h，之后改為每天上午、下午各觀察小鼠1次，連續(xù)觀察14天。小鼠死亡及毒性反應(yīng)情況記錄方法同預(yù)實(shí)驗(yàn)，末次觀察小鼠后全部處死，解剖肉眼觀察小鼠重要臟器是否有異常變化，并作肝臟、腎臟石蠟包埋、切片、HE染色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1小鼠一般情況和存活情況

兩組小鼠經(jīng)灌胃后，多數(shù)小鼠會(huì)出現(xiàn)困倦現(xiàn)象，活動(dòng)減少，呼吸加快現(xiàn)象，隨后的4小時(shí)密切觀察則困倦現(xiàn)象逐漸消失，呼吸逐漸平穩(wěn)，灌胃后1-2天即可恢復(fù)正常。觀察期間小鼠外觀毛色、行為、分泌物、排泄物等一般狀況均無(wú)明顯異常。連續(xù)觀察14天，CBCG組和對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)死亡。

2.2灌胃后小鼠進(jìn)食量及體質(zhì)量變化

兩組小鼠僅在給藥后3天內(nèi)進(jìn)食量減少，灌胃過(guò)程機(jī)械性刺激可能影響小鼠進(jìn)食，隨后的兩組進(jìn)食量沒(méi)有明顯的差異，比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖1)。與對(duì)照組相比，給藥組小鼠體質(zhì)量未見明顯減輕，增長(zhǎng)正常，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。

圖1 CBCB灌胃給藥對(duì)小鼠進(jìn)食量的影響

表1 CBCG對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響(n=10)

2.3灌胃后小鼠重要組織臟器的變化

觀察期結(jié)束后未出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象，解剖肉眼觀察小鼠肝、腎、心、脾臟、肺等重要臟器顏色、質(zhì)地等未見明顯異常，僅見給藥組部分小鼠有腸脹氣情況。肝臟HE染色，細(xì)胞核圓、位于中央，胞漿染成紅色，兩組之間未發(fā)現(xiàn)明顯差異；腎臟HE染色，組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞完整無(wú)損傷，兩組之間未發(fā)現(xiàn)明顯差異(圖2)。

A:對(duì)照組肝臟；B：給藥組肝臟；C：對(duì)照組腎臟；D：給藥組腎圖2 CBCG灌胃給藥對(duì)小鼠肝腎組織形態(tài)學(xué)的影響

3 討 論

急性毒性試驗(yàn)多進(jìn)行LD50的測(cè)定。1995年在東京召開的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)規(guī)范協(xié)調(diào)會(huì)議上提出動(dòng)物毒性試驗(yàn)不測(cè)LD50也可以。LD50不再是急性毒性試驗(yàn)的規(guī)范要求[9]。由于受小鼠灌胃體積和CBCG溶解度的限制，CBCG 5 g/kg，0.4 ml/10 g已達(dá)最大給藥體積、最大給藥濃度，預(yù)實(shí)驗(yàn)無(wú)法測(cè)出LD50。根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，因此正式實(shí)驗(yàn)時(shí)以CBCG 5 g/kg，0.4 ml/10 g灌胃給藥。

正式實(shí)驗(yàn)給藥組小鼠未出現(xiàn)死亡，未見明顯毒性表現(xiàn)。與對(duì)照組相比，給藥組小鼠在行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、排泄、皮毛等方面無(wú)明顯差異，體重增長(zhǎng)也無(wú)明顯差異。兩組小鼠進(jìn)食量?jī)H在灌胃后3天有所下降，其原因可能是灌胃機(jī)械性刺激，3天后小鼠進(jìn)食量增加，兩組進(jìn)食量無(wú)明顯差異。與對(duì)照組比較，解剖觀察發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠部分出現(xiàn)腸脹氣。兩組肝臟、腎臟、肺、脾臟等重要臟器外觀、質(zhì)地等未見明顯異常，肝臟腎臟HE染色無(wú)明顯差異。CBCG用藥量在5g/kg時(shí)未見明顯毒性反應(yīng)。因此，CBCG淀粉混懸液小鼠灌胃最大耐受量為≥5 g/kg。

感謝泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院高云生教授給予的指導(dǎo)，感謝泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所提供的研究平臺(tái)。

[1] 周廣禮，高允生，趙曉民，等.一種化學(xué)法工業(yè)化生產(chǎn)牛黃的方法[P].中國(guó), ZL2009 10013647.7[P].2011-6-8.

[2] 周廣禮，張豐雪，朱長(zhǎng)義.以大腸桿β-菌葡萄糖醛酸酶培育牛黃實(shí)驗(yàn)研究[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991，12(1)：13-14.

[3] 李珂，王唯紅，齊永秀.6種膽酸類成分的HPLC-ELSD測(cè)定法及在兩種牛黃中的含量比較[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2010,45(8)：626-629.

[4] 李珂，齊永秀，于秀玲.酶促牛黃與牛黃HPLC指紋圖譜比較研究[J].中成藥，2011:33(1)：1-5.

[5] 李珂.酶育牛黃與天然牛黃化學(xué)成分的比較研究[D].山東大學(xué),2010.

[6] 劉化俠， 魏寅翼，胡曉旭.酶育牛黃對(duì)肉瘤S180的抑制作用及免疫調(diào)節(jié)作用的初步研究[J].泰山醫(yī)學(xué)院,2012，33(10)：701-704.

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[9] 周宗燦．毒理學(xué)基礎(chǔ)[M]．北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2000：65-74．