連方,劉菲,帥振虹

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經皮穴位電刺激對高齡婦女卵細胞質量及Bcl-2、Bax的影響

連方1,劉菲2,帥振虹2

(1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,濟南 250011;2.山東中醫(yī)藥大學,濟南 250014)

觀察經皮穴位電刺激對體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期腎虛高齡婦女卵顆粒細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達及卵細胞質量的影響。將66例因輸卵管因素行IVF-ET的腎虛高齡婦女隨機分為治療組(經皮穴位電刺激治療)和對照組(偽針),每組33例。觀察兩組患者腎虛證候積分變化,HCG日單個卵雌激素(E2/卵泡數(shù))、優(yōu)卵率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率的差異,并應用蛋白印跡法(Western blot)檢測卵顆粒細胞Bcl-2、Bax蛋白表達。與對照組相比,治療組患者腎虛癥狀明顯改善(＜0.01),HCG日E2/卵泡數(shù)、優(yōu)卵率、優(yōu)胚率明顯升高(＜0.05),Bcl-2蛋白表達明顯增多(＜0.01),Bax蛋白表達明顯降低(＜0.01),獲卵數(shù)和臨床妊娠率無顯著差異(＞0.05)。Bcl-2、Bax蛋白表達與IVF相關參數(shù)有明顯相關性(＜0.05)。經皮穴位電刺激能改善高齡婦女腎虛癥狀,提高卵細胞及胚胎質量,此作用可能與調節(jié)顆粒細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達,降低顆粒細胞凋亡有關。

經皮穴位電刺激;Bcl-2;Bax;卵細胞質量;體外受精-胚胎移植

女性生育能力隨著年齡的增長逐漸下降,35歲以后妊娠機會顯著減少。在助孕技術中,高齡婦女卵細胞質量下降成為制約其臨床妊娠率的關鍵因素。顆粒細胞通過縫隙連接,以自分泌和旁分泌的方式對卵細胞起營養(yǎng)支持、信息傳遞等重要作用。Bcl-2、Bax蛋白為B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族成員,定位于線粒體膜,通過調節(jié)線粒體膜電位和線粒體膜的通透性來調控顆粒細胞凋亡,分別起抑制和促進顆粒細胞的凋亡的作用[1]。本研究觀察經皮穴位電刺激對行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的腎虛型高齡不孕患者卵顆粒細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達及卵細胞質量的影響,現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 研究對象

66例患者來源于2013年3月至2013年9月山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中西醫(yī)結合生殖與遺傳中心門診,隨機分為治療組和對照組,每組33例。兩組患者年齡、病程、治療前腎虛證候積分、治療前基礎內分泌水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(＞0.05),具有可比性。詳見表1-2。

表1 兩組患者一般資料比較 (±s)

表2 兩組患者治療前基礎內分泌水平比較 (±s)

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準

符合樂杰主編《婦產科學》[2]中不孕癥診斷標準;符合中國中西醫(yī)結合學會婦產科專業(yè)委員會1990年第三屆學術會議修訂的“女性不孕癥的診療標準”[3]中輸卵管阻塞診斷標準。

1.2.2 腎虛中醫(yī)辨證標準

主證為不孕,經色淡黯,或者月經遲發(fā),腰骶酸痛,脛膝酸軟或者足跟痛,舌質淡黯,苔白,兩尺脈沉細或者沉細弱;兼證為頭暈耳鳴,小腹冷,夜尿多,性欲減退。以上主證必須具備,兼證具備1～2項即可以診斷。

中醫(yī)癥狀積分標準[4],根據(jù)癥狀程度(癥狀影響日常生活;癥狀明顯;輕度癥狀;正常)分別積分,主證腰骶酸痛記6、4、2、0分,其余癥狀記3、2、1、0分。

1.3 納入標準

①年齡在35～45歲之間;②符合西醫(yī)輸卵管阻塞性不孕癥診斷標準;③符合中醫(yī)腎虛不孕癥辨證標準;④簽署知情同意書;⑤男方精液常規(guī)檢查正常。

1.4 排除標準

①其他原因所致不孕癥;②基礎內分泌FSH＞15mIU/mL者;③近3個月內應用激素類藥物者;④子宮不具備妊娠功能或嚴重軀體疾病不能承受妊娠者;⑤患有嚴重的精神疾患、泌尿生殖系統(tǒng)急性感染、性傳播疾病者;⑥患有《母嬰保健法》規(guī)定的不宜生育的遺傳性疾病者;⑦具有吸毒等嚴重不良嗜好者;⑧接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期者。

2 治療方法

2.1 治療組

采用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案超促排卵。促性腺激素(gonadotropin,Gn)啟動日至應用絨促性素(HCG)日給予經皮穴位電刺激治療,將韓氏治療儀的電極貼片貼于相應穴位上,關元、中極為一對正負極,雙側子宮、三陰交分別為一對正負極,強度以患者能耐受為度,持續(xù)30 min,隔日1次。常規(guī)取卵、體外受精、胚胎培養(yǎng)及移植。

2.2 對照組

采用GnRH-a長方案超促排卵。偽針的使用時間和穴位與治療組相同,與患者交談分散患者注意力,使用偽針(將長25 mm毫針剪去0.5寸,將斷面打磨圓滑,穿于一橡膠片上)于相應穴位置模擬毫針刺法但不刺破表皮,僅使患者有點觸感,使其認為毫針已刺入皮膚,用膠布固定橡膠片從而固定針身。常規(guī)取卵、體外受精、胚胎培養(yǎng)及移植。

3 治療效果

3.1 觀察指標

3.1.1 腎虛證候積分

分別計算患者入組時和HCG日腎虛證候積分。

3.1.2 IVF相關參數(shù)

HCG日E2/卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、優(yōu)卵率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率。卵細胞形態(tài)學(成熟度)分級標準[5],Ⅲ級卵細胞為優(yōu)質卵。胚胎按WIH評分系統(tǒng)[6],分數(shù)≥7分為優(yōu)質胚胎。胚胎移植(ET)后4～5星期做陰道B超檢查,見胎囊、胎芽反射及胎心者診斷為臨床妊娠。

3.1.3 顆粒細胞Bcl-2、Bax蛋白表達

實驗室回收卵母細胞后,留取卵泡液,提取顆粒細胞,進一步純化后用Western blot法測定。

3.2 統(tǒng)計學方法

應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差表示,采用獨立樣本檢驗,計數(shù)資料采用卡方檢驗;雙變量相關性分析采用相關分析。

3.3 治療結果

3.3.1 兩組患者腎虛證候積分比較

兩組患者HCG日腎虛證候積分及治療前后差值分別比較,差異均有統(tǒng)計學意義(＜0.01),治療組在腎虛證候改善方面優(yōu)于對照組。詳見表3。

表3 兩組患者腎虛證候積分比較 (±s,分)

注:與對照組比較1)＜0.01

3.3.2 兩組臨床妊娠率比較

兩組患者臨床妊娠率比較差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05),但治療組與對照組相比有增高趨勢。詳見表4。

表4 兩組臨床妊娠率比較 (n)

3.3.3 兩組患者IVF相關參數(shù)比較

與對照組相比,治療組HCG日E2/卵泡數(shù)、優(yōu)卵率、優(yōu)胚率均明顯升高(＜0.01),獲卵數(shù)無顯著差異(＞0.05),但治療組與對照組相比有增高趨勢。詳見表5。

3.3.4 兩組卵顆粒細胞Bcl-2和Bax蛋白表達比較

與對照組相比,治療組患者卵顆粒細胞Bcl-2蛋白表達顯著升高(＜0.01),Bax蛋白表達顯著降低(＜0.01)。詳見表6、圖1。

組別nE2/卵泡數(shù)(pg/mL)獲卵數(shù)(個)優(yōu)質卵率(%)優(yōu)胚率(%)E2/卵泡數(shù)(pg/mL) 治療組33259.77±25.451)13.58±6.55 82.85±19.421) 59.63±15.301) 259.77±25.451) 對照組33235.59±26.4412.03±6.6757.79±16.4037.72±27.63235.59±26.44

組別nBcl-2/actinBax/actin 治療組330.67±0.161) 0.34±0.171) 對照組330.50±0.200.51±0.20

注:與對照組比較1)＜0.01

圖1 治療組(4、5)對照組(1、2、3)Bcl-2、Bax蛋白表達

3.3.5 顆粒細胞Bcl-2、Bax蛋白與IVF相關參數(shù)相關性分析

兩組患者顆粒細胞Bcl-2與Bax蛋白表達呈明顯負相關(=-0.980,＜0.01);Bcl-2蛋白與HCG日E2/卵泡數(shù)呈明顯正相關(=0.325,＜0.01),與獲卵數(shù)呈明顯正相關(=0.634,＜0.01),與優(yōu)卵率呈明顯正相關(=0.547,＜0.01),與優(yōu)胚率呈明顯正相關(=0.717,＜0.01);Bax蛋白與HCG日E2/卵泡數(shù)呈明顯負相關(=-0.270,＜0.05),與獲卵數(shù)呈明顯負相關(=-0.653,＜0.01),與優(yōu)卵率呈明顯負相關(=-0.493,＜0.01),與優(yōu)胚率呈明顯負相關(=-0.694,＜0.01)。

4 討論

經皮穴位電刺激是對傳統(tǒng)針刺治療的改良,克服了針刺入皮膚時的疼痛感,無創(chuàng)[7],減少了長時間針刺造成的局部機械損傷,且刺激范圍大,操作方便,現(xiàn)亦被應用于輔助生殖領域。經皮穴位電刺激可從整體上調節(jié)機體內分泌和卵巢局部微環(huán)境,提高卵巢低反應患者臨床妊娠率[8],提高多囊卵巢綜合征患者卵泡液白血病抑制因子,改善其卵細胞和胚胎質量[9]。

中醫(yī)學認為腎虛在女性生殖機能衰老的過程中起決定作用,腎臟精氣虛衰,天癸少而竭,則經水無以行,卵細胞無以生,出現(xiàn)卵細胞發(fā)育不良、成熟延遲、萎縮及排出障礙等,導致高齡婦女生殖功能低下[10]。高齡不孕患者主要以腎精虛衰、沖任不固為基本特征,且使用外源性激素超促排卵,使多個卵泡生長發(fā)育成熟并取出,過度耗竭腎中陰陽,更易加重腎虛癥狀。故以補腎益精、調理沖任為基本治法,取關元、中極為主穴,以補腎益精培元,以三陰交、子宮為配穴,以調理沖任氣血。諸穴并用,以期達到補腎益精、調理沖任的目的。

本研究顯示,治療組患者腎虛癥狀改善程度、IVF相關參數(shù)均優(yōu)于對照組,說明經皮穴位電刺激在改善高齡婦女腎虛癥狀、提高卵細胞及胚胎質量方面有顯著效果。與對照組相比,治療組患者卵顆粒細胞Bcl-2蛋白表達明顯升高,Bax蛋白表達明顯降低,且二者呈負相關,作為影響顆粒細胞凋亡的因素,Bcl-2蛋白具有抑制顆粒細胞凋亡作用,Bax蛋白具有促進顆粒細胞凋亡作用[1],說明經皮穴位電刺激可以調節(jié)顆粒細胞凋亡相關蛋白的表達,降低顆粒細胞凋亡。研究顯示Bcl-2蛋白表達與IVF相關參數(shù)均呈明顯正相關,Bax蛋白表達與IVF相關參數(shù)呈明顯負相關,說明卵顆粒細胞Bcl-2、Bax蛋白的表達與卵細胞和胚胎質量密切相關,可有效預測卵細胞、胚胎質量。綜上所述,經皮穴位電刺激可以通過補腎益精、調理沖任,改善高齡婦女腎虛癥狀,提高卵細胞及胚胎質量,此作用機理可能與調節(jié)卵顆粒細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達,降低顆粒細胞凋亡有關。

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Effect of Transcutaneous Acupoint Electrical Stimulation on Oocyte and Bcl-2 and Bax in the Older Women

1,2,2.

1.250011,; 2.250014,

To observe the effect of transcutaneous acupoint electrical stimulation (TAES) on the ovarian granulosa cell apoptosis-related proteins, Bcl-2 and Bax, as well as the oocyte quality in the older women with kidney deficiency receiving in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET).Sixty-six older women with kidney deficiency who were receiving IVF-ET because of the fallopian tube factor were randomized into a treatment group (intervened by TAES) and a control group (intervened by sham acupuncture), 33 in each group. The kidney-deficiency syndrome score, HCG E2/follicle count per day, excellent follicle rate, excellent embryo rate, and clinical pregnancy rate were observed and compared between the two groups; Western blot was used to detect the expression of protein Bcl-2 and Bax.Compared to the control group, the treatment group had significant improvement in kidney-deficiency symptoms (＜0.01), significant increases in the HCG E/follicle count per day, excellent follicle rate, and excellent embryo rate (＜0.05), enhanced expression of Bcl-2 protein (＜0.01), and decreased expression of Bax protein (＜0.01); while there were no significant differences in comparing the retrieved oocyte number and clinical pregnancy rate (＞0.05). The expression of Bcl-2 and Bax proteins were markedly correlated with IVF-related indexes (＜0.05).TAES can improve the kidney-deficiency symptoms and the quality of oocyte and embryo in older women; this action is possibly related to the regulation of expression of the cell apoptosis-related protein Bcl-2 and Bax, as well as the decrease of granulose cell apoptosis.

Transcutaneous acupoint electrical stimulation; Bcl-2; Bax; Oocyte quality; In vitro fertilization-embryo transfer

1005-0957(2014)12-1097-03

R246.3

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.12.1097

2014-03-20

連方(1957 - ),女,主任醫(yī)師,博士