女性腫瘤患者卵細(xì)胞凍存研究進(jìn)展及問(wèn)題

程振寧

北京特度生物科技有限公司(100005)

女性惡性腫瘤患者中，保持生育能力是一種可行的選擇，尤其對(duì)于某些早期癌癥患者，包括早期宮頸癌、高分化卵巢癌、IA單側(cè)卵巢癌等，這些患者腫瘤控制或者治愈后有較強(qiáng)的生育要求。本文就女性腫瘤患者卵細(xì)胞凍存歷史、相關(guān)研究及現(xiàn)存問(wèn)題進(jìn)行綜述。

1 卵細(xì)胞凍存歷史

卵細(xì)胞的凍存技術(shù)較胚胎凍存晚，1983年Veeck等[1]首次將未成熟卵細(xì)胞成功妊娠。1986年首次成熟卵母細(xì)胞凍融后嬰兒出生，1995年卵母細(xì)胞凍融與細(xì)胞內(nèi)單精子注射技術(shù)結(jié)合，隨后陸續(xù)有卵母細(xì)胞凍融嬰兒出生[2]。2013年美國(guó)新診癌癥患者生育能力保留指南更新，卵母細(xì)胞凍存地位得以提升，不再以經(jīng)驗(yàn)性選擇做為標(biāo)準(zhǔn)措施。近年來(lái)，卵細(xì)胞凍存技術(shù)以及生育能力保持成為關(guān)注的熱點(diǎn)[3-4]。我國(guó)在2004年慢速程序化冷凍卵細(xì)胞培育的首例試管嬰兒出生，2006年玻璃化冷凍成熟卵細(xì)胞取得成功，同年國(guó)內(nèi)首例“三凍嬰兒”(凍精、凍卵、凍胚)誕生 ,標(biāo)志著我國(guó)的配子、胚胎冷凍技術(shù)已達(dá)到國(guó)際水平。

2 卵細(xì)胞凍存相關(guān)研究

2.1 凍存技術(shù)的研究

目前較成熟凍存技術(shù)包括：慢速凍存、快速凍存、玻璃化凍存等。其中，玻璃化凍存具有標(biāo)準(zhǔn)化程度高、簡(jiǎn)單、可重復(fù)以及高效等特點(diǎn)[5]。玻璃化冷凍法是利用高濃度的冷凍保護(hù)劑快速冷凍技術(shù)，快速降溫過(guò)程中樣本脫水，剩余水分直接轉(zhuǎn)化為非晶體化狀態(tài)，并在-196 ℃的低溫環(huán)境中固定于玻璃化狀態(tài)。玻璃化凍存法也是美國(guó)“卵子銀行”主流的凍存方法[6-7]。隨著納米、微米技術(shù)與仿生學(xué)材料、合成材料的研究與應(yīng)用，給超低溫凍存帶來(lái)創(chuàng)新和技術(shù)進(jìn)步，如最小容量玻璃化技術(shù)ref36、閉合系統(tǒng)玻璃化凍存法[8-9]。

在臨床中，許多腫瘤患者在短時(shí)間內(nèi)要求保持生育能力，如在卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌介入治療前。保持生育能力的唯一選擇是快速獲得卵母細(xì)胞并進(jìn)行冷凍，這一過(guò)程中常常涉及未成熟卵母細(xì)胞的冷凍。GV期、MI期卵母細(xì)胞的成熟需要特殊培養(yǎng)基(如MI99、IVF卵裂液)和嚴(yán)格的培養(yǎng)條件(6%CO2、5% O2、89% N2，37℃)。Chan等[10]研究，從5例次日接受擇期癌癥手術(shù)的患者取出53顆卵母細(xì)胞，其中36顆體外成熟(成熟率67.9%)。有研究顯示，GV期、MI期卵細(xì)胞可能對(duì)慢速冷凍的耐受更好，但隨之而來(lái)的染色體多倍體和非整倍體情況不可以避免[11-12]。更大的困難在于GV期、MI期的卵細(xì)胞冷凍解凍后體外成熟，冷凍過(guò)程降低了未成熟卵子發(fā)育成熟的潛能，且目前尚無(wú)未成熟卵細(xì)胞冷凍后復(fù)蘇成功生育的案例報(bào)道。

2.2 卵細(xì)胞凍存生育結(jié)果的研究

高質(zhì)量綜述和臨床對(duì)照研究肯定了玻璃化凍存的效果。Paramanantham等[13]對(duì)過(guò)去30年卵細(xì)胞凍存研究的180篇文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，對(duì)慢速凍存與玻璃化凍存復(fù)蘇后卵細(xì)胞情況進(jìn)行比較，從存活率(57.9%比78.9%)、受精率(64.7%比 72.8%)、臨床妊娠率(7.6%比18.2%)、受精卵種植率(4.3%比9.3%)得出玻璃化技術(shù)優(yōu)于慢速凍存技術(shù)的結(jié)論。另一項(xiàng)臨床研究對(duì)比玻璃化冰凍卵細(xì)胞組與胚胎凍存，結(jié)果顯示，卵細(xì)胞凍存和胚胎凍存種植率、臨床妊娠率、累積臨床妊娠率、正在進(jìn)行的妊娠率兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而自然流產(chǎn)率胚胎凍存組較高，認(rèn)為：卵細(xì)胞玻璃化凍存達(dá)到和胚胎凍存相同的嬰兒出生率[14]。

對(duì)于30歲左右的年輕腫瘤患者或非腫瘤患者女性玻璃化凍存卵細(xì)胞存活率較高，可達(dá)到臨床活產(chǎn)。Chang 等[15]就30～39歲女性卵細(xì)胞玻璃化凍存技術(shù)的前瞻臨床研究中，卵細(xì)胞玻璃化冷凍復(fù)蘇后卵細(xì)胞存活率為79.6%，β-人絨毛膜促性腺激素陽(yáng)性率、臨床妊娠率、著床率分別為59%、45.4%、30.1%，總活產(chǎn)出生率為5.9%，結(jié)論認(rèn)為：30～39歲女性玻璃化凍存技術(shù)可達(dá)到高種植率、妊娠率。Garcia等[16]開(kāi)展的一項(xiàng)為期5年的多中心、回顧性、觀察性研究，比較中位年齡(31.9±5.1)歲腫瘤患者和非腫瘤患者使用玻璃化凍存技術(shù)差異，研究表明兩組患者玻璃化冷凍卵母細(xì)胞存活率、妊娠率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且控制性超促排卵技術(shù)具有現(xiàn)實(shí)意義。

近幾年的卵細(xì)胞凍存的病例報(bào)道也給我們很好的鼓舞：無(wú)性生殖細(xì)胞瘤患者通過(guò)凍存卵細(xì)胞保存生育功能1例病例報(bào)告[17]。2016年法國(guó)首例化療前凍存卵細(xì)胞玻璃化凍存且成功生育的IV期霍奇金淋巴瘤患者[18]。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)腫瘤患者行卵細(xì)胞凍存并成功生育的報(bào)道。2015年協(xié)和醫(yī)院對(duì)22～40歲的原發(fā)性乳腺癌患者生育計(jì)劃與治療決策進(jìn)行調(diào)查，262例乳腺癌患者中僅2例行胚胎凍存，其余患者均未進(jìn)行胚胎、卵細(xì)胞、卵巢凍存等保持生育措施。中國(guó)腫瘤患者，尤其是年輕的腫瘤患者雖然有較高的生育需求和計(jì)劃，但生育能力保持的現(xiàn)狀很不樂(lè)觀[19]。

3 現(xiàn)存問(wèn)題分析

3.1 卵細(xì)胞凍存安全

雖然美國(guó)社會(huì)生殖醫(yī)學(xué)不再將卵細(xì)胞凍存視為實(shí)驗(yàn)，也有利好的數(shù)據(jù)顯示玻璃化卵細(xì)胞與新鮮卵細(xì)胞相比并沒(méi)有風(fēng)險(xiǎn)增加，也沒(méi)有增加先天性畸形的后代數(shù)量。然而，這些數(shù)據(jù)尚不完善，不足以排除風(fēng)險(xiǎn)增加的可能性[20]。冷凍可對(duì)卵母細(xì)胞紡錘體造成損傷，干擾減數(shù)分裂，若為未成熟卵母細(xì)胞，需采取冷凍復(fù)蘇之后培養(yǎng)成熟或者先體外培養(yǎng)成熟達(dá)到MⅡ期再冷凍兩種方式。Stefanie等[21]通過(guò)研究未成熟卵發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于MI期與GV期，體外培養(yǎng)達(dá)到MⅡ期后進(jìn)行冷凍復(fù)蘇能夠獲得較高的成熟率，并且優(yōu)胚率也更高。

卵細(xì)胞凍存的短期安全性可以用先天性畸形、不良產(chǎn)科結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)，但是長(zhǎng)期安全性方面，如嬰幼兒長(zhǎng)期隨訪的現(xiàn)有研究較少[22]。2016年發(fā)表的卵細(xì)胞凍存出生的大樣本研究，納入2005年～2013年向意大利國(guó)立衛(wèi)生院上報(bào)的2152名卵子冷凍產(chǎn)生的嬰兒，從先天性畸形和胎兒染色體數(shù)目異常兩個(gè)維度分析卵細(xì)胞凍存的安全性。2152名卵子冷凍產(chǎn)生的嬰兒中先天性畸形發(fā)生率為0.9%，這一比例并未高于正常自然分娩嬰兒先天性畸形發(fā)生率[23]。

然而，對(duì)細(xì)胞學(xué)研究、動(dòng)物模型的分子基因水平的分析，提示卵細(xì)胞玻璃化冷凍改變卵細(xì)胞的微絲構(gòu)象，并對(duì)卵細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。卵細(xì)胞冷凍是否足夠安全，尤其卵子冷凍后出生嬰兒長(zhǎng)期評(píng)估的長(zhǎng)期大樣本研究是亟待解決的問(wèn)題[24-26]。2015年NEJM雜志上發(fā)表的一項(xiàng)研究，更是明確指出30歲女性行卵巢刺激獲得卵細(xì)胞的短期副作用：卵巢過(guò)度刺激綜合征、未來(lái)潛在的生育影響以及多種婦科惡性疾病的長(zhǎng)期副作用[27]。

3.2 卵細(xì)胞捐獻(xiàn)

30歲左右部分低分化腫瘤患者一般涉及到卵細(xì)胞捐獻(xiàn)。女性一生共計(jì)400多個(gè)卵細(xì)胞，總體數(shù)目少，卵細(xì)胞捐獻(xiàn)本就存在著一定難度。而每次卵細(xì)胞凍存的中位凍存數(shù)目為6個(gè)，整個(gè)捐獻(xiàn)周期約為1。5個(gè)月，這無(wú)疑增加了卵細(xì)胞捐獻(xiàn)難度[28]。此外，阻止女性捐獻(xiàn)卵細(xì)胞的情況還有以下3種：首先卵細(xì)胞捐獻(xiàn)存在并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，包括卵巢過(guò)度刺激癥、不孕癥、手術(shù)并發(fā)癥、激素的副作用、注射疼痛和卵巢囊腫等；其次卵細(xì)胞捐獻(xiàn)女性主要集中在18～25歲，該年齡段的女性更容易被網(wǎng)絡(luò)上不真實(shí)的捐獻(xiàn)信息所迷惑，進(jìn)而不能捐獻(xiàn)；再次，年輕女性不能承受捐獻(xiàn)卵細(xì)胞的心理負(fù)擔(dān)。

Braga等[29]在對(duì)新鮮卵細(xì)胞和玻璃化卵細(xì)胞的對(duì)比研究中發(fā)現(xiàn)：玻璃化法凍存卵細(xì)胞解凍后行卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射，胚胎發(fā)育能力較新鮮卵細(xì)胞低，而移植到“更易接受”的子宮內(nèi)膜后，妊娠率和植入率卻較高[28]。

3.3 卵細(xì)胞凍存費(fèi)用

在歐洲van 等[30]研究，卵細(xì)胞凍存每例活產(chǎn)費(fèi)用為19560，具體花費(fèi)如下，卵細(xì)胞凍存費(fèi)用(3次)9126，年保存費(fèi)用40，每IVF周期費(fèi)用3042，流產(chǎn)費(fèi)用740[29]。Hirshfeld等[31]注意到卵母細(xì)胞冷凍保存每一例活產(chǎn)花費(fèi)135520美元，并就卵細(xì)胞凍存和后續(xù)妊娠等過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)的費(fèi)用研究：卵細(xì)胞凍存費(fèi)用約26000美元，卵細(xì)胞保存的年平均費(fèi)用為275美元，每進(jìn)行一次IVF的費(fèi)用為9547(7,000～15,225)美元。

美國(guó)就卵細(xì)胞凍存的商業(yè)現(xiàn)狀對(duì)7家“卵子銀行”進(jìn)行橫斷面研究，7家“卵子銀行”采用3種不同的操作模式。各銀行建議的凍存卵細(xì)胞最低數(shù)量為6顆(4～7顆)，每顆卵細(xì)胞的費(fèi)用約為2225(1500～2500)美元，7家“卵子銀行”的臨床妊娠率差異較大，從暫無(wú)臨床妊娠數(shù)據(jù)(2家)到臨床妊娠率12.0%，總體臨床妊娠率約7.7%[32]。

中國(guó)就卵細(xì)胞凍存費(fèi)用尚無(wú)明確的文獻(xiàn)，1篇關(guān)于卵細(xì)胞凍存的報(bào)道中指出，取卵細(xì)胞的手術(shù)費(fèi)用平均人民幣2萬(wàn)元左右，凍存卵細(xì)胞每年的保存費(fèi)用為1000～2000元人民幣，加之后續(xù)治療費(fèi)用，費(fèi)用預(yù)計(jì)在3萬(wàn)～5萬(wàn)元人民幣不等。故卵細(xì)胞凍存絕對(duì)是需要多次就診、花費(fèi)大量時(shí)間和經(jīng)濟(jì)費(fèi)用的一項(xiàng)臨床行為。

4 展望

在女性腫瘤患者接受放療、化療前，對(duì)其卵母細(xì)胞進(jìn)行采集，能夠保存生育能力，該方式具有干預(yù)少、消耗時(shí)間短以及不延誤下一步治療等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)不會(huì)致使腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，降低復(fù)發(fā)潛在危險(xiǎn)。卵細(xì)胞凍存為可行性高的臨床高效方式，必須腫瘤科、教育、放射科、法律、婦產(chǎn)科以及社會(huì)科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域工作人員的通力協(xié)作。現(xiàn)今，胚胎凍融技術(shù)正在日益完善，但由于卵母細(xì)胞自身具有特殊結(jié)構(gòu)易產(chǎn)生冷凍創(chuàng)傷，因而卵子凍融技術(shù)進(jìn)展比較緩慢。V?lz等[33]指出人類卵細(xì)胞凍融技術(shù)發(fā)展至今開(kāi)展已30余年，越來(lái)越多的凍卵新生兒出生，卵細(xì)胞凍存現(xiàn)有數(shù)據(jù)和凍存技術(shù)都為腫瘤患者卵細(xì)胞凍存提供了可靠依據(jù)。近年來(lái)備受爭(zhēng)議的生殖細(xì)胞基因編輯技術(shù)在腫瘤患者卵細(xì)胞凍存中能否得到應(yīng)用，如對(duì)腫瘤患者的卵細(xì)胞進(jìn)行基因編輯改變母代腫瘤疾病的腫瘤攜帶基因，進(jìn)而改變胚胎的DNA?；蚓庉嫾夹g(shù)尚屬未知，但我們?nèi)砸吹饺祟惵鸭?xì)胞凍存的研究和臨床應(yīng)用仍然處于探索階段，凍存技術(shù)有待提高，長(zhǎng)期安全性的臨床數(shù)據(jù)有待建立，倫理方面尚需進(jìn)一步探討，凍存費(fèi)用能否降低都是今后未來(lái)要面臨和解決的問(wèn)題。

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