隋 月，孫 姣，王春玲，王 宇，程曉波，鄧意輝*

（1．沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016；2. 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，江蘇 連云港 222000）

輔酶Q10納米裸晶的制備及表征

隋 月1，孫 姣2，王春玲1，王 宇1，程曉波1，鄧意輝1*

（1．沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016；2. 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，江蘇 連云港 222000）

目的制備不含穩(wěn)定劑且穩(wěn)定存在的輔酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）納米裸晶。方法 分別以沉降法和逆向沉降法制備納米裸晶，并運用激光粒度儀、zeta電位儀和透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）考察制劑的理化性質(zhì)。結(jié)果 確定最終處方工藝，得到粒徑范圍在80~700 nm內(nèi)的納米裸晶，其中粒徑為(82.6 ± 5.4)、(118.2 ± 14.5)、(388.6 ± 19.8)和(675.1 ± 53.4) nm制劑的zeta電位分別為-(34.20 ± 0.47)、-(29.23 ± 0.34)、-(17.68 ± 0.37)和-(6.54 ± 1.78) mV，透射電鏡觀察納米裸晶呈圓球狀。結(jié)論 成功制備了不含穩(wěn)定劑的CoQ10納米裸晶。

藥劑學；納米裸晶；沉降法；逆向沉降法；CoQ10；粒徑

納米裸晶是粒徑在納米級別、未添加任何輔料、純藥物的納米晶體。納米晶體由于具有大的比表面積，傾向于聚集或沉淀來減小由比表面積增大而產(chǎn)生的過剩自由能，故常需要添加表面活性劑或高分子聚合物等穩(wěn)定劑[]1。但在研究中發(fā)現(xiàn)，添加劑的使用會影響粒子的行為[]2，干擾結(jié)果的判斷；因此，制備不含任何穩(wěn)定劑的納米晶體顯得尤為重要。迄今為止，在制藥領域?qū){米裸晶的報道寥寥無幾[]3-6，本文在前期試驗的基礎上，選擇藥物CoQ10，制備了未添加任何穩(wěn)定劑也能穩(wěn)定存在的納米晶體，并對其性質(zhì)進行表征，為探討粒徑與溶解度及體內(nèi)行為的關(guān)系奠定基礎。

1 儀器與材料

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義英峪予華儀器廠），高速分散機（德國IKA T18 ULTRA TURRAX?），Nicomp-380激光粒度測定儀（美國PSS公司），JM-1200EX透射電鏡（日本電子公司）。

CoQ10原料藥（云南楚雄太陽藥業(yè)有限公司），無水乙醇（分析純，天津博迪化工股份有限公司），重蒸水（實驗室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 CoQ10納米裸晶的制備

2.1.1 篩選指標

2.1.1.1 外觀

納米裸晶因比表面積很大，在未添加任何穩(wěn)定劑的情況下，容易出現(xiàn)沉淀、分層等現(xiàn)象，所以可通過觀察納米裸晶混懸液的外觀，對制劑穩(wěn)定性進行評價。

2.1.1.2 平均粒徑及多分散系數(shù)

粒徑及其分布可以從微觀角度反映納米裸晶混懸液內(nèi)部的變化，粒徑分布情況通常用平均粒徑及多分散系數(shù)（polydispersity index，PI）表示，PI越小，粒子分布越均一。故選擇平均粒徑和PI值為處方和工藝篩選的指標。

2.1.2 沉降法

沉降法是在攪拌的條件下，將含藥物的有機相迅速分散于水相中，由于巨大的溶解性差異導致藥物析出，并因機械力作用快速分散成為較均一納米晶體的方法。

2.1.2.1 基本處方工藝

在50 ℃水浴中將CoQ10（質(zhì)量濃度為1 g·L-1)溶于乙醇，作為有機相，重蒸水組成水相，在一定轉(zhuǎn)速攪拌下將有機相注入水相中，繼續(xù)攪拌一段時間后，放冷至室溫即得。

2.1.2.2 乙醇體積分數(shù)的選擇

以“2.1.2.1”條的方法制備納米裸晶，得到制劑中乙醇體積分數(shù)分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%和40%。當乙醇體積分數(shù)為5%時，出現(xiàn)明顯的沉淀；乙醇體積分數(shù)為10%和15%時，測定制劑的粒徑和PI值分別為125.2、130.6 nm和0.109、0.112，且制劑外觀良好，放置10 d后仍穩(wěn)定；乙醇體積分數(shù)為30%以上，所得制劑粒徑大于200 nm，放置0.5 h后出現(xiàn)沉淀。故最終確定乙醇體積分數(shù)為10%。

2.1.2.3 藥物質(zhì)量濃度的選擇

按照“2.1.2.1”條的方法，制備藥物質(zhì)量濃度分別為0.17、0.33、0.50、1.00和2.00 g·L-1的CoQ10納米裸晶，制劑外觀均良好，平均粒徑和PI值見表1。由表可知，粒徑隨藥物質(zhì)量濃度的增加而增大。

表 1 藥物質(zhì)量濃度對CoQ10納米晶體粒徑的影響Table 1 Effect of the concentration of CoQ10 on the particle size of CoQ10 nanocrystal

2.1.2.4 轉(zhuǎn)速的選擇

按照“2.1.2.1”條方法，分別將轉(zhuǎn)速設為10 000、14 000、18 000和22 000 r·min-1制備CoQ10納米裸晶。當轉(zhuǎn)速為10 000 r·min-1時，發(fā)現(xiàn)混懸液的液面上漂浮著一些大粒子，這可能是由于轉(zhuǎn)速小體系分散不完全所致；而轉(zhuǎn)速大于14 000 r·min-1，得到的制劑粒徑接近200 nm。綜合考慮將轉(zhuǎn)速確定為14 000 r·min-1。

2.1.2.5 攪拌時間的選擇

按照“2.1.2.1”條方法制備納米裸晶混懸液，攪拌時間分別選擇10、15、20、30和45 s，制劑外觀均良好，平均粒徑和PI值見表2。由表2可知，攪拌時間大于20 s，在機械攪拌下粒子間碰撞幾率增大，導致最終體系粒度分布寬；當攪拌10、15和20 s時，所得的制劑粒徑較小，通過PI值間的比較，確定攪拌時間為15 s。

表 2 攪拌時間對CoQ10納米晶體粒徑的影響Table 2 Effect of stirring time on the particle size of CoQ10 nanocrystal

2.1.2.6 有機相溫度的選擇

按照“2.1.2.1”條的處方，有機相的溫度分別選擇為50、55、60、65和70 ℃，制劑外觀均良好，平均粒徑和PI值見表3。由表3可知，有機相溫度范圍在60~65 ℃時，得到的粒徑值較小。當有機相溫度達到70 ℃，溫度過高，使粒子間碰撞加劇，致使粒子聚集，制劑粒徑變大，故將溫度確定為60 ℃。

表 3 溫度對CoQ10納米晶體粒徑的影響Table 3 Effect of temperature on the particle size of CoQ10 nanocrystal

2.1.3 逆向沉降法

逆向沉降法系在攪拌的條件下，將水相以一定速度滴入溶解藥物的有機相中，并經(jīng)機械力作用分散成均一的納米晶體。

2.1.3.1 基本處方工藝

在50 ℃水浴中將CoQ10（質(zhì)量濃度為1 g·L-1)溶于乙醇，作為有機相，重蒸水組成水相，在一定轉(zhuǎn)速攪拌下，將水相注入有機相中，繼續(xù)攪拌一段時間后，放冷至室溫即得制劑。

2.1.3.2 注入速度的選擇

按照“2.1.3.1”條方法制備納米裸晶，其中水相的滴入速度分別為3、15、20、30和60 mL·min-1，以外觀、平均粒徑和PI值為指標進行篩選，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著注入速度的增加，藥物是在分散良好的情況下逐漸析出，粒徑增加均勻，外觀均較好。另外，考慮速度控制的問題，將注入速度的最佳范圍確定為15~30 mL·min-1。

圖 1 注入速度對CoQ10納米晶體粒徑的影響Fig. 1 Effect of injection speed on the particle size of CoQ10 nanocrystal

2.1.3.3 攪拌速度的選擇

按照“2.1.3.1”條方法制備納米裸晶，其中攪拌速度分別為250、500、750、1 000和1 500 r·min-1，結(jié)果見圖2。當轉(zhuǎn)速為1 500 r·min-1時，由于攪拌過于劇烈，制劑已經(jīng)貼壁旋轉(zhuǎn)，冷卻至室溫時，杯壁上漂浮少量油滴；而轉(zhuǎn)速過慢，藥物分散性差且粒徑分布較寬。因此，轉(zhuǎn)速的最佳范圍確定為500 ~ 1 000 r·min-1。

圖 2 攪拌速度對CoQ10納米晶體粒徑的影響Fig. 2 Effect of stirring speed on the particle size of CoQ10 nanocrystal

2.1.3.4 攪拌時間的選擇

水相加入至有機相后，攪拌時間對粒度分布的影響較大。攪拌時間短，藥物溶液分散不均一，容易聚集；攪拌時間長，增加納米晶體間的碰撞幾率，粒子也易發(fā)生聚集。因此本文對攪拌時間進行了考察，攪拌時間為1或2 min，制劑表面漂油，說明攪拌不夠充分，藥物未分散完全導致聚集；攪拌3 min后，所得制劑外觀良好，平均粒徑和PI值較?。欢鴶嚢? min時，制劑粒徑明顯增大，表明有部分粒子因攪拌碰撞而聚集。故將攪拌時間確定為3 min。

2.1.4 最終處方和工藝

2.1.4.1 沉降法

制備粒徑小于200 nm的納米裸晶。80 nm①粒徑制劑的制備：在60 ℃水浴中，以5 g·L-1CoQ10的無水乙醇溶液為有機相，重蒸水作為水相。在14 000 r·min-1高速分散下將有機相快速注入到水相中，分散15 s，放置至室溫即得。②120 nm粒徑制劑的制備：在60 ℃水浴中，以10 g·L-1CoQ10的無水乙醇溶液為有機相，重蒸水作為水相。在14 000 r·min-1高速分散下將有機相快速注入到水相中，分散15 s，放置至室溫即可。

2.1.4.2 逆向沉降法

制備粒徑大于200 nm的納米裸晶。①400 nm粒徑制劑的制備：在50 ℃水浴中，以10 g·L-1CoQ10的無水乙醇溶液為有機相，重蒸水作為水相。在750 r·min-1的磁力攪拌下，以30 mL·min-1的速度將水相滴入到有機相中，攪拌3 min，放置至室溫即可。②700 nm粒徑制劑的制備：在50 ℃水浴中，以10 g·L-1CoQ10的無水乙醇溶液為有機相，重蒸水作為水相。在500 r·min-1的磁力攪拌下，以15 mL·min-1的速度將水相滴入到有機相中，攪拌3 min，放置至室溫即可。

2.2 輔酶Q10納米裸晶的表征

2.2.1 外觀

CoQ10納米裸晶混懸液外觀見圖3。不同粒徑的制劑外觀有很大不同，隨著粒徑的增加，外觀由半透明逐漸向不透明轉(zhuǎn)變。

圖 3 不同粒徑CoQ10納米晶體在室溫貯存24 h后的外觀Fig. 3 Suspensions of CoQ10 nanocrystals with different sizes after storage for 24 h at room temperature

2.2.2 粒度分布及zeta電位

粒度大小以動態(tài)光散射法測定，用平均粒徑和PI值表示。Zeta電位可評價制劑表面的荷電情況，影響其體內(nèi)藥物動力學及組織分布。本研究采用PSS-NICOMP380 ZLS測定各制劑的zeta電位。各制劑的平均粒徑、PI及zeta電位值見表4，所有制劑均荷負電，電位值隨粒徑變化而改變。

表 4 Co Q10納米晶體的粒徑大小、PI值和zeta電位值Table 4 Particle size, PI and zeta potential of CoQ10 nanocrystal (n=4)

2.2.3 形態(tài)

采用負染法觀察CoQ10納米裸晶。將樣品稀釋適當?shù)谋稊?shù)，取適量滴于以火棉膠作為支持膜的銅網(wǎng)上，用濾紙吸去多余液體，銅網(wǎng)浸泡于20 g·L-1磷鎢酸溶液中染色3~5 min，而后自然晾干，用透射電鏡觀察納米裸晶的形態(tài)。不同粒徑的CoQ10納米裸晶透射電鏡照片見圖4，粒子呈圓球形。

圖 4 不同粒徑CoQ10 納米晶體的透射電鏡圖，其中A為80 nm；B為120 nm；C為400 nm；D為700 nm (bar =500 nm)Fig. 4 TEM micrographs of CoQ10 nanocrystal with particle size of 80 nm (A), 120 nm (B), 400 nm (C) and 700 nm (D) (bar=500 nm)

3 討論

3.1 制備方法的選擇

納米混懸劑的制備方法有很多種，但總體來講可分為“Bottom up”、“Top down”及二者的聯(lián)用[-]78?！癟op down”法是大粒子在機械力的作用下碎裂變成小粒子，包括研磨法和高壓勻質(zhì)法等，但這類方法存在一些問題，例如，球磨法在粉碎過程中會對樣品造成污染，產(chǎn)品溶液黏著在球珠表面或球磨腔內(nèi)表面；高壓均質(zhì)過程中的高溫、高壓、高能對于溫度敏感型藥物不適用。“Bottom up”法也稱沉降法，其原理是基于藥物在不同溶劑中的溶解性差異，使藥物過飽和析出，并通過控制晶核形成和生長而得到納米尺寸的藥物晶體。該法操作簡單、易控且重現(xiàn)性好，制備過程中未引入高溫、高壓，從而避免了藥物降解及對儀器的污染。因此，本文選擇沉降法和逆向沉降法制備納米裸晶。

3.2 納米裸晶制備的影響因素

納米混懸液的形成分為2個階段：晶核形成和晶體的生長，二者共同決定晶體的質(zhì)量[]9。過飽和度是晶核形成的推動力，攪拌能加速晶核生成和晶體生長，溫度可促進表面化學反應速度的提高，增加結(jié)晶速度，因此實驗中分別對溶劑和反溶劑的比例、藥物質(zhì)量濃度、有機相溫度、注入速度及攪拌速度進行考察。

對于藥物質(zhì)量濃度與形成晶體大小的關(guān)系，研究者們持有不同的觀點。Mersmann等[]10認為藥物質(zhì)量濃度大，過飽和度高，成核快且成核率高，則形成晶體粒徑較?。欢鳵odriguez等[]11研究表明藥物質(zhì)量濃度小，體系黏度低，在兩相界面上形成的晶核少，對溶劑向反溶劑的擴散影響小，所得粒徑小。本文實驗結(jié)論與后者相似，作者認為這可能是藥物性質(zhì)、溶劑黏度和藥物質(zhì)量濃度綜合作用的結(jié)果。

3.3 PI值的作用

近年來，文獻中多采用PI值評價制劑粒徑的均一程度。當PI<0.1時，系統(tǒng)為單分散體系或近單分散體系；PI在0.1~0.25內(nèi)，粒徑分布較窄；當PI>0.7時，體系的尺寸分布非常寬，很可能不適合光散射的方法分析[]12。本實驗中制備的制劑PI均小于0.3，可認為是均勻體系。但在制劑評價中，也要注意大粒子浮于制劑表面或沉于底部時，測定的PI值可能很小。因此，在判定制劑中粒子分布時，除以PI值為指標外，還要結(jié)合制劑的外觀綜合進行判斷。

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Preparation and characterization of Coenzyme Q10naked nanocrystal

SUI Yue1, SUN Jiao2, WANG Chun-ling1, WANG Yu1, CHENG Xiao-bo1, DENG Yi-hui1*
（1. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China；2. Hengrui Medicine Corporation, Jiangsu 222000,China）

ObjectiveTo prepare stable CoQ10naked nanocrystal without any surfactant or polymer. Methods CoQ10naked nanocrystals were prepared by precipitation method and anti-precipitation method. The laser light scattering technique, zeta potential analyzer and TEM were employed to study the physicochemical properties of naked nanocrystal. Results Naked nanocrystals with different sizes ranging from 80 nm to 700 nm were prepared. The zeta potential of nanocrystals with the size of (82.6 ± 5.4)、(118.2 ± 14.5)、(388.6 ± 19.8) and (675.1 ± 53.4) nm were -(34.20 ± 0.47)、-(29.23 ± 0.34)、-(17.68 ± 0.37) and - (6.54 ± 1.78) mV, respectively. TEM images show that nanocrystals were spherical. Conclusions Through optimizing the formulations and preparation conditions, CoQ10naked nanocrystals were successfully prepared without stabilizer.

pharmaceutics; naked nanocrystal; precipitation method; anti-precipitation method; coenzyme Q10; size

R 94

A

（2014）03–0073–08

(本篇責任編輯：馬麗麗)

2014–03–12

隋月（1989-），女（漢族），吉林農(nóng)安人，碩士研究生，E-mail suiyue629@163.com；*通訊作者：鄧意輝（1964-），男（漢族），湖南花垣人，教授，博士，主要從事靶向制劑的研究，Tel. 024-23986316，E-mail dds-666@163.com。