游元，曾建國

（湖南農(nóng)業(yè)大學，獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，長沙410128）

一測多評法測定蓼博顆粒中4種有效成分的含量

游元，曾建國?

（湖南農(nóng)業(yè)大學，獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，長沙410128）

建立中藥復方制劑蓼博顆粒中4種有效成分一測多評的定量檢測方法，以用于質(zhì)量評價。以血根堿為內(nèi)參物，建立白屈菜紅堿、沒食子酸與穿心蓮內(nèi)酯的相對校正因子，利用校正因子計算白屈菜紅堿、沒食子酸與穿心蓮內(nèi)酯的含量，實現(xiàn)一測多評；同時采用外標法測定以上4種成分的含量，比較兩種方法的差異，驗證一測多評法的準確性和科學性。蓼博顆粒中4種成分含量的計算值與實測值無顯著差異。表明建立的只用1種對照品同時測定蓼博顆粒中4種有效成分的方法準確、可行，適合中藥的多指標質(zhì)量評價模式的要求。

高效液相色譜法；蓼博顆粒；一測多評；血根堿

蓼博顆粒復方是由辣蓼、穿心蓮、博落回葉和魚腥草四味中藥材經(jīng)提取濃縮而制成的顆粒劑，現(xiàn)代研究表明，蓼博顆粒制劑中含有的沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、血根堿和白屈菜紅堿，具有抑菌［1－2］、抗炎［3］和抗細菌性腹瀉［4］的功效?？股匾恢睆V泛用于治療仔豬腹瀉，目前抗生素的濫用以及其殘留對人體產(chǎn)生的危害已經(jīng)引起了人們的廣泛關注［5－7］，蓼博顆粒臨床上旨在替代抗生素用于預防和治療斷奶仔豬的腹瀉。

本文主要通過一測多評法建立蓼博顆粒的質(zhì)量標準。一測多評法是指利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關系和比例關系，只測定一個成分（對照品可得到者）實現(xiàn)多個成分（對照品難以得到或難供應）的同步測定。近年來關于一測多評的研究思路和方法在多種藥材或飲片中多個成分的測定中得到了驗證［8－10］。采用常規(guī)的外標法和內(nèi)標法建立蓼博顆粒的質(zhì)量標準需要4種對照品，有些對照品缺乏，即使有對照品，價格也昂貴，而采用一測多評法可以解決常規(guī)方法在復方質(zhì)量標準研究中的不足。本文采用一測多評法以克服這一難題，即只使用一種對照品，通過引入相對校正因子，實現(xiàn)其它待測成分的測定，達到了用單一對照品對蓼博顆粒制劑多指標的質(zhì)量控制的目的。對蓼博顆粒質(zhì)量標準的建立提供了科學的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1260 Series高效液相色譜儀，島津LC20－30V高效液相色譜儀；AE240型電子天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；KQ5200DE型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；冷凍離心機（HERMLE 2323K，德國）；DHG－9246A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。色譜柱：Welth Ultimate XB－C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），華普XCharge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和KromasilC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 藥品與試劑 沒食子酸對照品來源為中國食品藥品檢定研究院，批號110831－201204，含量為89.9%；穿心蓮內(nèi)酯對照品來源為中國食品藥品檢定研究院，批號110797－201108，含量為98.7%；鹽酸血根堿和鹽酸白屈菜紅堿對照品由湖南美可達生物資源有限公司提供，批號分別是S20091001和100820，含量均大于98.0%；蓼博顆粒，批號：20130511、20130512、20130513、20130514、20130515、20140709、20140710、20140711、20140712和20140713，湖南美可達生物資源有限公司在研產(chǎn)品；水為Milli－Q超純水；甲醇（色譜純，Merck）；其他試劑均為分析純。

1.3 高效液相色譜條件 采用Welth Ultimate XBC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.1%磷酸溶液（A）與甲醇（B），流速為0.8 mL／min，洗脫梯度為：0～10 min，12%B；10～11 min，12%～40%B；11～30 min，40%～70%B；30～40 min，70%～95%B；40～45 min，95%B；45～45.1 min，95%～12%B；45.1～50 min，12%B。柱溫25℃，進樣量5 μL。血根堿、白屈菜紅堿的檢測波長為274 nm，沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯的檢測波長為225 nm。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品約15 mg，穿心蓮內(nèi)酯對照品約5 mg，鹽酸血根堿和鹽酸白屈菜紅堿對照品各約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.15 mg／mL沒食子酸、0.05 mg／mL穿心蓮內(nèi)酯和0.10 mg／mL血根堿與白屈菜紅堿對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液2 mL，至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含沒食子酸0.03 mg、穿心蓮內(nèi)酯0.01 mg、鹽酸血根堿0.02 mg和鹽酸白屈菜紅堿0.02 mg的混合對照品溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備 取蓼博顆粒樣品1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－1.0%的鹽酸溶液100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理60 min，取出，放冷，稱定重量，用甲醇－1.0%的鹽酸溶液補足減失的重量，取上清液置10 mL離心管中，13500 r／min離心10 min，取上清液，用0.45 μm的濾膜過濾，即得。

2 結果

2.1 專屬性考察 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，進樣分析，結果見圖1－圖7。陰性對照在相應位置處未見色譜峰，方法專屬性良好。

圖1 對照品溶液（225 nm）的高效液相色譜圖

圖2 對照品溶液（274 nm）的高效液相色譜圖

圖3 供試品溶液（225 nm）的高效液相色譜圖

圖4 供試品溶液（274 nm）的高效液相色譜圖

圖5 缺博落回葉陰性樣品（274 nm）的高效液相色譜圖

圖6 缺穿心蓮陰性樣品（225 nm）的高效液相色譜圖

圖7 缺辣蓼陰性樣品（225 nm）的高效液相色譜圖

2.2 線性關系考察 分別精密量取對照品儲備液0.5、1、2、4、6和8 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件分析，分別以峰面積對進樣濃度進行回歸，求得回歸方程，結果見表1。

表1 蓼博顆粒4種有效成分的線性關系和范圍

2.3 相對校正因子計算 以血根堿為內(nèi)參物，參照公式fkm＝fk／fm＝（Wk×Am）／（Wm×Ak）［11］，fkm為校正因子；式中Ak為內(nèi)參物k的峰面積；Wk為內(nèi)參物k的濃度；Am為待測組分m的峰面積；Wm為待測組分m的濃度。按“1.3”項下色譜條件，考察不同濃度對照品對fkm的影響。按“2.3”項下公式計算，結果見表2。

2.4 不同高效液相色譜儀與色譜柱上相對校正因子的考察 取“1.4.1”項下混合對照品溶液，按“1.3”項下色譜條件，“2.3”項下計算鹽酸血根堿對鹽酸白屈菜紅堿、沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯的校正因子。在Agilent1260 Series和島津LC20－30V高效液相色譜儀系統(tǒng)上考察了不同品牌的3根色譜柱，見表3。

表2 血根堿對白屈菜紅堿、沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯的校正因子

表3 不同色譜儀及不同色譜柱的校正因子（n＝3）

2.5 待測組分色譜峰的定位 利用相對保留值（rk／s）定位，rk／s按下式計算：rk／s＝tR（k）／tR（s）（k為其它組分，s為內(nèi)參物）。再根據(jù)峰形判斷，即能夠準確確定目標峰的準確位置，結果見表4。由表4可知，RSD＜5%，表明利用rk／s進行色譜峰定位是可行的。

2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液5 μL，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、鹽酸血根堿和鹽酸白屈菜紅堿的峰面積，峰面積的RSD分別為0.20%、0.12%、0.18%和0.17%，表明在此方法下儀器精密度符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液5 μL，分別于配制后的0、2、4、6、12、24、48 h測定，沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、鹽酸血根堿和鹽酸白屈菜紅堿峰面積的RSD分別為0.19%、0.28%、0.34%和0.23%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗 取批號為20130513的樣品，按“1.4.2”項下方法制備供試品溶液6份，分別測定沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、血根堿和白屈菜紅堿的含量，測得含量的RSD分別為0.23%、0.29%、0.17%和0.56%，表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的蓼博顆粒樣品（批號：20130513），每份1 g，置200 mL的量瓶中，分別精密加入80%、100%、120%含量的沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、鹽酸血根堿和鹽酸白屈菜紅堿對照品，混合均勻，作為添加樣品，按“1.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、血根堿和白屈菜紅堿的回收率分別為99.46%、98.02%、99.27%和97.85%，RSD依次為1.03%、1.29%、1.37%和0.97%。

2.10 一測多評法與外標法測定結果比較 分別精密吸取不同批次樣品供試品溶液各5 μL注入高效液相色譜儀，記錄血根堿、白屈菜紅堿、沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯的峰面積，采用外標法和一測多評法計算其含量，結果見表5。統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，對外標法與一測多評法得到的蓼博顆粒中血根堿、白屈菜紅堿、沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯含量進行比較，結果（P＞0.05）表明兩種方法測得的含量沒有顯著性差異。

表5 不同方法對蓼博顆粒中4中有效成分含量測定結果（n＝3）mg／g

3 討論與小結

3.1 樣品前處理方法的選擇 本文對不同的提取方式、提取溶劑和提取時間進行了考察。結果表明，在提取時間和提取溶劑相同的條件下超聲法與回流法的提取效果沒有顯著性差異；分別采用10%鹽酸溶液和1%鹽酸甲醇溶液作為提取溶劑，結果表明，沒食子酸在兩種溶劑的提取效率沒有差異，在提取血根堿、白屈菜紅堿和穿心蓮內(nèi)酯時后者的提取效率遠大于前者；分別對30、60、150 min的提取時間進行考察，結果表明，提取時間60 min與30 min有顯著性差異，而與提取150 min沒有顯著性差異。試驗最終確定了“1.4.2”項下的方法。

3.2 檢測波長的選擇 文獻報道沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯在200～250 nm波長處有較大吸收，參照紫外可見分光光度法，在200～400 nm的波長范圍進行掃描，結果顯示沒食子酸在225 nm處有最大吸收，穿心蓮內(nèi)酯在232 nm處有最大吸收。本實驗綜合考慮選擇225 nm作為沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯的檢測波長。同樣的方法得到274 nm作為血根堿與白屈菜紅堿的檢測波長。且在一測多評法中采用每種成分的最大吸收波長可以提高在不同儀器下的重復性。

3.3 內(nèi)參物的選擇 本試驗以血根堿為內(nèi)參物，鹽酸血根堿為醇溶性化合物，其鹽的穩(wěn)定性強，試驗中發(fā)現(xiàn)其對照品溶液放置較長時間后峰面積沒有變化，在制劑中的含量也較高，因此選擇血根堿為內(nèi)參物對制劑中的4種成分進行測定，體現(xiàn)了一測多評的優(yōu)勢。

3.4 一測多評法色譜峰的定位 復方制劑中HPLC圖譜的色譜峰較多，一測多評法中一個關鍵問題是如何準確定位色譜峰的位置。目前主要有三個方法：1、色譜法；2、光譜法；3、光譜法與色譜法相結合。試驗中通過使用待測成分的最大吸收波長，提高了分析方法的靈敏度和各色譜峰的豐度，且由于目標峰位置的雜峰干擾較少，再結合色譜法的相對時間保留值可以判斷出目標峰的準確位置。

本試驗采用一測多評法同時對蓼博顆粒的四種有效成分進行了含量檢測。試驗結果表明，采用一測多評法計算的含量結果與外標法測得的含量結果沒有顯著性差異，可以在缺少白屈菜紅堿、沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯對照品的情況下，通過校正因子與色譜峰定位計算其含量，以實現(xiàn)對蓼博顆粒4種成分的質(zhì)量控制，并對含有以上成分的其它產(chǎn)品的含量測定具有一定的參考價值。

［1］ 馬宏華.當前抗生素的使用問題［J］.中國現(xiàn)代藥物應用，2014，8（1）：128－129.

［2］ 馬秀麗.規(guī)模養(yǎng)殖場濫用抗生素的危害與對策［J］，當代畜牧，2014，2（1）：45－47.

［3］ 馮宋崗，曾建國.HPLC－MS／MS法檢測豬肉中苯并菲啶類生物堿的研究［J］，中國獸藥雜志，2014，48（4）：48－51.

［4］ 徐麗，曾建國，程辟，等.血根堿－黃芩苷、白屈菜紅堿－黃芩苷離子對化合物體外抗菌活性和急性毒性研究［J］.中南藥學，2012，4（1）：39－42.

［5］ 王斌，程辟，曾建國，等.博落回中季銨類苯并啡啶類生物堿的提取及其硫酸氫鹽的抗菌活性和急性毒性［J］.農(nóng)藥學學報，2013，15（3）：85－87.

［6］ 管晨，李敏，任慶杰，等.穿心蓮內(nèi)酯通過抗炎和調(diào)節(jié)免疫提高EV71感染小鼠的生存率［J］.免疫學雜志，2013，29（9）：737－744.

［7］ 李軍，毛勁.白辣散治療牛濕熱泄瀉［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2009，28（4）：65－67.

［8］ Zou C，Lu F H，Mao W，et al.Chinese herbal medicine Danshen formulations for preventing renal disease in Henoch－Schonlein Purpura：a systematic review and meta－analysis［J］.J Altern Complement Med，2012，18（4）：394.

［9］ 尹萌，孟月蘭，聞琍毓.關黃柏中生物堿類成分的“一測多評”［J］.中草藥，2011，42（6）：1093－1096.

［10］藍天鳳，王曉，王岱杰，等.一測多評法測定丹參中4種丹參酮類成分［J］.中草藥，2012，43（12）：2420－2423.

［11］王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測多評法建立的技術指南［J］.中國中藥雜志，2011，36（6）：657－658.

（編輯：陳希）

Determination of Four Kinds of Effective Components in Compound Liaobo Powder by Multi－component with a Single Maker

YOU Yuan，ZENG Jian－guo?
（Hunan Agricultural University，National and Local Union Engineering Research Center for the Veterinary Herbal Medicine Resources and Initiative，Changsha 410128，China）

To establish a quantitative analysis method of multi－component by a single maker（QAMS）for the four components quantitative detection in Liaobo powder for its quantitative evaluation.Sanguinarine was used as the reference，the calibration factor of gallic acid，andrographolide and chelerythrine to that of sanguinarine were calculated respectively to get each relative calibration factor and the contents of active constituents were calculated by the relative calibration，and then，the method was set up.At the same time，external standard method was used to detect the contents of the four constituents，the two methods were compared to validate the accuracy and feasibility of the new method.No significate difference were found in the quantitative results of the four active constituents between the measured value and the calculated value.In this study，only one reference substance was used to determination of four effective ingredients in Liaobo powder at the same time.The method is accurate and feasible and suitable for the requirements of the multi－index evaluation model of Chinese traditional medicine.

HPLC；compound Liaobo powder；QAMS；sanguinarine

2014－09－05

A

1002－1280（2014）11－0037－06

S853.73

國家科技支撐計劃（2011BAD34B02）

游元，碩士研究生，從事功能產(chǎn)品開發(fā)與評價。

曾建國。E－mail：ginkgo＠world－way.net