周紅霞，杜丹丹，王穎，李慧素，吳寧鵬?

（1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008；2.鄭州百瑞動(dòng)物藥業(yè)有限公司，鄭州450000）

12種獸藥中非法添加甲氧芐啶的HPLC－PDA檢查方法的建立

周紅霞1，杜丹丹2，王穎2，李慧素1，吳寧鵬1?

（1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008；2.鄭州百瑞動(dòng)物藥業(yè)有限公司，鄭州450000）

采用十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液－甲醇（73∶27，V／V）為流動(dòng)相，建立了測(cè)定12種獸藥中非法添加甲氧芐啶的HPLC－PDA法，并采用峰純度檢查和光譜相似度檢查輔助對(duì)照品比對(duì)方法，對(duì)非法添加藥物進(jìn)行確證。在此液相條件下，對(duì)7種獸藥粉散劑和5種注射液藥物，進(jìn)行添加回收試驗(yàn)和檢測(cè)限的測(cè)定。結(jié)果顯示，甲氧芐啶在粉劑中三個(gè)濃度（1%、5%、10%）添加回收率為74.6%～115.0%，RSD為0.1%～7.6%，在注射液中三個(gè)濃度（0.5%、1%、2%）的添加回收率為87.0%～119.7%，RSD為0.9%～4.1%。甲氧芐啶在各制劑中的檢測(cè)限為0.5 mg／g（0.25 mg／mL）。改變?cè)囼?yàn)條件后對(duì)峰純度指示、光譜相似度進(jìn)行考察，仍能滿足要求。

甲氧芐啶；峰純度檢查；光譜相似度檢查；高效液相色譜－二極管陣列檢測(cè)

甲氧芐啶（Trimethoprim，TMP）是一種常用抗菌藥，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌有抗菌作用，有抑制二氫葉酸還原酶的作用，為磺胺增效劑，主要與磺胺類(lèi)制劑組成復(fù)方制劑，用于擴(kuò)大抗菌譜，增強(qiáng)抗菌活性，在臨床上廣泛應(yīng)用［1］。一些不法企業(yè)常違規(guī)在其他藥劑中添加甲氧芐啶，以得到增效作用，實(shí)際上不但沒(méi)有起到增效作用，反而會(huì)使動(dòng)物產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)，長(zhǎng)期大劑量的使用本品會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生致畸作用，其在動(dòng)物體內(nèi)的殘留，也會(huì)給人類(lèi)的健康帶來(lái)危害［2］。為了打擊非法添加行為，為使用過(guò)程中甲氧芐啶的監(jiān)控提供可靠依據(jù)，建立獸藥中非法添加甲氧芐啶的檢查方法，顯得尤為重要。農(nóng)業(yè)部公告2508號(hào)公布了僅硫酸慶大霉素注射液一種制劑中非法添加甲氧芐啶的檢查方法［3］，本研究建立了鹽酸多西環(huán)素可溶性粉、磷酸泰樂(lè)菌素預(yù)混劑、替米考星預(yù)混劑及喹諾酮類(lèi)制劑等共12種獸藥制劑中非法添加甲氧芐啶的HPLC－PDA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對(duì)照品來(lái)源 甲氧芐啶對(duì)照品，含量100.0%，批號(hào)H0160704，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2 樣品來(lái)源 鹽酸多西環(huán)素可溶性粉、磷酸泰樂(lè)菌素預(yù)混劑、替米考星預(yù)混劑、喹諾酮類(lèi)制劑等12種制劑，均來(lái)市售產(chǎn)品，經(jīng)檢測(cè)均不含甲氧芐啶。

1.1.3 試劑 甲醇，色譜純；磷酸二氫鉀，分析純；純化水，實(shí)驗(yàn)室MILLIPORE超純水儀自制。

1.1.4 儀器設(shè)備 高效液相色譜儀（Waters2695，PDA，Empower2色譜工作站軟件）；MILIPORE超純水器；METTLER XP205電子分析天平；超聲波清洗器：KQ－3200E型；1 mL注射器。

1.2 方法

1.2.1 陰性空白溶液配制 精密稱?。咳。╆幮詷悠芳s1.0 g（或2.0 mL），置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲10 min，靜置，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密量取5.0 mL，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，備用。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甲氧芐啶對(duì)照品25 mg，于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，得到500 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相分別稀釋制成1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，置4℃冰箱中保存。

1.2.3 色譜條件 參照文獻(xiàn)［4］色譜柱Waters Xbridge C18（4.6×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.02 mol／L磷酸二氫鉀（27∶73）；二極管陣列（PDA）檢測(cè)器，采集波長(zhǎng)范圍為200～400 nm，分辨率為1.2 nm；記錄270 nm波長(zhǎng)處的色譜圖；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照1.2.3項(xiàng)色譜條件，依法測(cè)定1.2.2項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積（y）對(duì)濃度（x）進(jìn)行線性回歸。

1.2.5 回收率試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［5］精密稱取甲氧芐啶原料10、50、100 mg各3份，分別置50 mL容量瓶中，加入1 g供試品，混勻，加適量流動(dòng)相溶解，超聲約10 min，靜置，定容至刻度；從上述溶液中精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋?zhuān)ㄈ輷u勻，得相當(dāng)于甲氧芐啶20、100、200 μg／mL濃度添加水平的溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，按照1.2.3項(xiàng)下液相條件記錄色譜圖。（粉劑及預(yù)混劑按照上述方法操作，注射液略有不同，各取2 mL空白注射液制劑，甲氧芐啶原料添加量為10、20、40 mg各3份，得相當(dāng)于甲氧芐啶20、40、80 μg／mL濃度的3個(gè)添加水平，其他操作相同。）

1.2.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按1.2.3項(xiàng)下色譜條件，分別對(duì)甲氧芐啶對(duì)照品溶液、供試品（添加甲氧芐啶）溶液和陰性空白溶液進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 檢測(cè)限 精密稱取制劑1 g（或精密量取注射液2 mL），分別精密加入1.2.2項(xiàng)下的甲氧芐啶對(duì)照品溶液適量，制成系列添加濃度0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20 μg／mL。精密量取10 μL，注入液相色譜儀，按照1.2.3項(xiàng)下液相條件記錄色譜圖。依法測(cè)定。光譜圖失真前的濃度為該測(cè)試藥物的檢測(cè)限［6］。

1.2.8 耐用性試驗(yàn) 改變柱溫為25、30、35℃；改變流動(dòng)相比例分別為80∶20、75∶25、70∶30；改變流速分別為0.4、0.6、0.8 mL／min；選擇不同品牌色譜柱（Waters SunfireTMC18（4.6×250 mm，5 μm）；Agilent XORBA SB－C18（3.0×250 mm，5 μm）；SHIMADZU VP（4.6×150 mm，5 μm）；Waters Xbridge C18（4.6×150 mm，5 μm），對(duì)其峰型、分離度、峰純度指示、出峰時(shí)間進(jìn)行考察。

2 結(jié)果與分析

2.1 峰純度檢查 對(duì)供試品溶液色譜圖中甲氧芐啶峰進(jìn)行峰純度檢查［6］，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。結(jié)果顯示，甲氧芐啶的純度角度小于純度閾值（圖2、表1），表明在此液相條件下，甲氧芐啶的出峰處無(wú)其他干擾峰，為單一物質(zhì)峰，方法可行。

圖1 供試品（磷酸泰樂(lè)菌素預(yù)混劑）添加甲氧芐啶光譜圖及色譜圖

圖2 供試品（磷酸泰樂(lè)菌素預(yù)混劑）添加甲氧芐啶純度檢查圖

2.2 光譜相似度檢查 對(duì)供試品溶液中甲氧芐啶的光譜圖與光譜庫(kù)進(jìn)行匹配，匹配角度小于匹配閾值（表1），表明供試品溶液中相應(yīng)色譜峰的光譜與甲氧芐啶對(duì)照品的光譜非常相似，可認(rèn)為是同一物質(zhì)。

2.3 專(zhuān)屬性考察 通過(guò)供試品空白試驗(yàn)排除對(duì)于被測(cè)物的干擾，以甲磺酸培氟沙星可溶性粉為例，結(jié)果表明在甲氧芐啶出峰處無(wú)干擾（圖3、圖4）。

表1 峰純度檢查結(jié)果表

圖3 添加樣品色譜圖

圖4 空白基質(zhì)（樣品和試劑）色譜圖

同時(shí)，峰純度檢查結(jié)果顯示在此液相條件下，甲氧芐啶為單一物質(zhì)峰。峰純度檢查：甲氧芐啶色譜峰光譜均勻，純度較高，可認(rèn)為單一物質(zhì)。光譜相似度檢查：供試品溶液甲氧芐啶色譜峰與光譜圖中甲氧芐啶對(duì)照品的光譜匹配。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 將1.2.2項(xiàng)中標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（y）對(duì)濃度（x）進(jìn)行線性回歸，甲氧芐啶的回歸方程Y＝21525X＋3002.8和相關(guān)系數(shù)r為0.9999。結(jié)果表明：甲氧芐啶在1～500 μg／mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 回收率試驗(yàn) 考慮到本試驗(yàn)中甲氧芐啶對(duì)照品使用量較大，本試驗(yàn)用符合純度要求的獸藥原料藥代替對(duì)照品進(jìn)行添加試驗(yàn)，即在陰性空白樣中分別添加甲氧芐啶原料藥，共添加3個(gè)濃度，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果獲得回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。該方法中粉劑、預(yù)混劑中添加甲氧芐啶的回收率為74.6%～115.0%，RSD為0.1%～7.6%；注射液中添加甲氧芐啶的回收率為87.0%～119.7%，RSD為0.9%～4.1%。說(shuō)明該檢測(cè)方法可靠，添加回收結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 獸藥粉劑、預(yù)混劑中添加甲氧芐啶回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 獸藥注射液中添加甲氧芐啶回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 檢測(cè)限 綜合考慮色譜圖峰型、峰面積和甲氧芐啶有效濃度等因素，結(jié)果表明，濃度為0.5 μg／mL，光譜圖失真；濃度為1 μg／mL，光譜圖不失真。以光譜圖失真前的濃度作為方法的檢測(cè)限，供試品中甲氧芐啶的檢測(cè)限分別為0.5 mg／g（粉散劑）、0.25 mg／mL（注射液）（圖5）。

圖5 添加甲氧芐啶濃度為1 μg／mL的光譜圖及色譜圖

2.7 耐用性 柱溫、流動(dòng)相比例、流速、色譜柱的改變對(duì)分離度、峰純度指示、光譜相似度的考察結(jié)果顯示，能夠滿足要求，只是保留時(shí)間變化。甲氧芐啶保留時(shí)間受柱溫影響較小，隨柱溫升高，保留時(shí)間略提前；結(jié)果顯示隨流動(dòng)相有機(jī)相比例的增加，甲氧芐啶保留時(shí)間縮短；隨著流速的增加，保留時(shí)間明顯提前；4款不同品牌色譜柱均可用于該檢查，僅保留時(shí)間不同，方法耐用性較好。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 利用二極管陣列檢測(cè)器，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收?qǐng)D譜掃描，甲氧芐啶在203、270 nm波長(zhǎng)處有最大吸收?？紤]到200 nm附近有“末端吸收”，而且在液相色譜分離中常用的溶劑如甲醇、乙腈等在此波長(zhǎng)下有紫外吸收；對(duì)本文所選的12種獸藥制劑進(jìn)行紫外掃描發(fā)現(xiàn)，在270 nm附近均不會(huì)產(chǎn)生干擾作用，故選擇270 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 相關(guān)文獻(xiàn)資料報(bào)道［3，7－9］使用的流動(dòng)相有：乙腈－0.0174 mol／L磷酸溶液（20∶80），甲醇－0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液（30∶70），甲醇－0.1 mol／L磷酸二氫鉀溶液（pH為2.5）（30∶70），考慮甲氧芐啶的穩(wěn)定性、出峰時(shí)間是否漂移、峰型是否對(duì)稱等，含有磷酸溶液的流動(dòng)相，甲氧芐啶主峰隨著時(shí)間的延長(zhǎng)向前漂移，不穩(wěn)定，最終確定流動(dòng)相為甲醇：0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液，并對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行考察，以出峰時(shí)間、色譜峰寬以及干擾基質(zhì)的分離情況等作為考察點(diǎn)，通過(guò)試驗(yàn)，最終確定流動(dòng)相比例為甲醇－0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液（27∶73）。

3.3 稀釋液的選擇 參考《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2010年版）甲氧芐啶的測(cè)定方法，根據(jù)甲氧芐啶的溶解性：在三氯甲烷中略溶，在乙醇或丙酮中微溶，在水中幾乎不溶，在冰醋酸中易溶解［10］，本次試驗(yàn)比較了多種稀釋液溶劑系，發(fā)現(xiàn)乙腈、甲醇、不同比例的甲醇水和乙腈水、流動(dòng)相進(jìn)行溶解時(shí)，采用流動(dòng)相進(jìn)行稀釋?zhuān)籽跗S啶峰型對(duì)稱，無(wú)雜質(zhì)峰的干擾，最終確定流動(dòng)相為溶媒。

3.4 回收試驗(yàn)的影響因素 本試驗(yàn)中，乳酸諾氟沙星可溶性粉的添加濃度為10%時(shí)，回收率相對(duì)偏低，其主要原因是樣品處理過(guò)程中采用超聲溶解，會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可能使得目標(biāo)分析物沒(méi)有完全地溶解，從而造成回收率偏低。煙酸諾氟沙星注射液的添加濃度為0.5%時(shí)，回收率相對(duì)偏高，最高可達(dá)119.7%，主要原因可能為稱樣量較小（10 mg左右），天平讀數(shù)波動(dòng)較大，造成回收率結(jié)果偏高。

歐洲聯(lián)盟對(duì)于動(dòng)物性食品中獸藥的使用有著嚴(yán)格的調(diào)節(jié)控制，對(duì)抗生素、促生長(zhǎng)劑、抗菌藥物（如甲氧芐啶）等獸藥的最大殘留量進(jìn)行檢測(cè)和控制時(shí)，采用高效液相－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC－MS）［11－12］對(duì)抗菌藥物中甲氧芐啶進(jìn)行測(cè)定。我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告2508號(hào)中對(duì)11個(gè)獸藥非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)方法［3］，采用高效液相色譜法（HPLC－UV）對(duì)甲氧芐啶進(jìn)行測(cè)定。本研究建立的對(duì)12種制劑中非法添加甲氧芐啶藥物的檢測(cè)方法，為國(guó)內(nèi)首個(gè)建立的對(duì)甲氧芐啶藥物監(jiān)測(cè)的HPLC－PDA法，該方法操作簡(jiǎn)便，具有高效高分離度的特點(diǎn)，具有很高的參考應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器，通過(guò)對(duì)稀釋液、波長(zhǎng)以及流動(dòng)相的考察，建立了獸藥中非法添加甲氧芐啶的HPLC－PDA檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了添加藥物與其他物質(zhì)峰的色譜分離，經(jīng)峰純度檢查確保添加藥物出峰處無(wú)干擾，同時(shí)該方法較穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于其他獸藥中非法添加甲氧芐啶的檢測(cè)，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

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（編輯：侯向輝）

Determination of Trimethoprim in the 12 Kinds of Verterinary Drugs by HPLC－PDA

ZHOU Hong－xia1，DU Dan－dan2，WANG Ying2，LI Hui－su1，WU Ning－peng1?
（1.Henan Institute of Veterinary Drug Control，Zhengzhou 450008，China；2.Zhengzhou Bairui Animal Pharmaceutical Co Ltd，Zhengzhou 450000，China）

C18 column was used，mobile phase was phosphate buffer and methnol（73∶27，V／V），and established a method for determination of trimethoprim in the 12 kinds of veterinary drugs by HPLC－PDA.Peak purity test and spectrum similar test were helped to identify the trimethoprim.Under this liquid condition，the test of added recycling，the determination of detection limit were operated.Results showed that the added recycling rate of TMP in the veterinary powder under three levels（1%，5%，10%）were 74.6%～115.0%，the RSD were 0.1%～7.6%.and injection under three levels（0.5%，1%，2%）were 87.0%～119.7%，the RSD were 0.9%～4.1%.Detection limit of trimethoprim in the preparation has got by this method was 0.5 mg／g（0.25 mg／mL）.Changing the test conditions，the purity test，spectral similarity can meet the requirements.

trimethoprim；peak purity test；spectrum similar test；HPLC－PDA

2014－07－28

A

1002－1280（2014）11－0043－06

S859.83

周紅霞，研究員，從事獸藥質(zhì)量監(jiān)測(cè)與監(jiān)督。

吳寧鵬。E－mail：wnppeking2002＠163.com