張巖，胡永浩，楊帆，鄭海學 甘肅農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070 中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原學國家重點實驗室 口蹄疫國家參考實驗室，甘肅 蘭州 730046

口蹄疫病毒外源序列插入位點的研究進展

張巖1，胡永浩1，楊帆2，鄭海學2
1 甘肅農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070 2 中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原學國家重點實驗室 口蹄疫國家參考實驗室，甘肅 蘭州 730046

伴隨著對口蹄疫病毒 (FMDV) 蛋白結構功能的深入研究，發(fā)現FMDV能夠表達外源基因片段。通過對FMDV的基因進行改造和修飾研究，進而實現了不同應用目的，如提高病毒滴度、引入標記、提高免疫應答、降低致病性等。文中主要從FMDV接受外源基因插入位點角度來介紹現階段關于FMDV表達外源基因相關進展。

口蹄疫病毒，外源基因，插入位點

口蹄疫 (Foot and mouth disease，FMD) 是由口蹄疫病毒 (Foot and mouth disease virus，FMDV) 引起的一種高度傳染性疾病，主要感染偶蹄動物 (主要是牛、豬和羊等)。不僅對畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經濟損失，也對畜產品的國際貿易帶來巨大的負面影響[1-2]。

FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，有7種血清型，包括A、O、C、Asia 1和SAT 1、2和3。FMDV基因組為單股正鏈RNA，病毒基因組由8 500個堿基左右組成，RNA被衣殼包裹，其正二十面體衣殼由4種結構蛋白VP1-VP4各60 份拷貝構成。FMDV翻譯成1個多聚蛋白，該多聚蛋白被蛋白酶裂解成結構蛋白 (VP1、VP2、VP3和VP4) 和非結構蛋白 (L、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3Dpol)[2]。目前反向遺傳學技術在FMDV研究中應用廣泛，國內外很多學者利用反向遺傳學在FMDV基因組上插入外源基因的方法來研究FMDV的復制和感染過程，并在這一方面取得了較大的進展。

在病毒上引入標記，然后檢測標記來確定病毒不同時期的狀態(tài)是研究病毒中常用的方法，同時也有在病毒上引入外源基因將病毒作為載體用于應用研究。因此病毒能夠接受外源基因插入的位點是首要解決的問題。接下來我們從現階段FMDV能夠表達外源基因的區(qū)域來進行詳細介紹。

1 前導蛋白L區(qū)引入外源基因片段

FMDV的前導蛋白L蛋白具有木瓜樣蛋白酶特性。FMDV可以識別兩種密碼子，因而具有兩種編碼產物Lab和Lb。兩種形式的蛋白酶均能夠降解宿主細胞的翻譯起始因子eIF4G，從而抑制宿主“帽子”依賴性的mRNA翻譯，導致宿主表達干擾素的水平降低，進而抑制宿主免疫應答[3]。由于L蛋白在FMDV逃避宿主免疫方面的特性，L蛋白對于FMDV的重要性不言而喻。1995年Piccone等[4]發(fā)現FMDV L蛋白的基因在病毒復制過程中并不是完全必需的，當保留了編碼L蛋白序列Lab和Lb的AUG之間的84 nt堿基就能保持病毒的活性。在1996年Brown等[5]在研究L蛋白缺失FMDV毒力時，通過感染牛發(fā)現L蛋白缺失的病毒致病性相比原毒有所下降。Piccone等[6]在2010年成功拯救出3株含有外源片段的L蛋白缺失重組FMDV，后續(xù)的動物實驗證實了L蛋白在參與感染過程的重要性。2011年Piccone等[7]在L蛋白的Lab和Lb之間引入了一個含有酶切位點的氨基酸序列，然后在該位點依次引入流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)、Flag和TC標簽，構建了3株重組病毒 (圖1)。在成功拯救出病毒后，在細胞水平檢測到了重組病毒中外源片段的表達。這證明了編碼L的蛋白區(qū)域具有攜帶和表達外源片段的能力。對L區(qū)進行反向遺傳操作也是降低致病性提高生物安全性的重要途徑，作者研究團隊利用突變L基因抑制天然免疫的功能性位點，獲得了對宿主動物無致病性、不排毒以及免疫應答快的重組FMDV。

圖1 FMDV全基因及構建質粒簡圖[7]Fig. 1 Schematic diagram of the FMDV genome and plasmids used in this study[7].

2 VP1區(qū)引入外源基因

FMDV的VP1表面存在一個被高度保守的Arg-Gly-Asp (RGD) 修飾的環(huán)狀結構，經研究發(fā)現這個特殊的環(huán)狀結構能夠被細胞表面的αν整聯蛋白的家族受體 (ανβ1、ανβ3、ανβ6和ανβ8)所識別[8-11]。研究表明多種血清型的FMDV VP1的G-H環(huán)結構同時也是一個抗原位點[9,12-13]。VP1的G-H環(huán)狀結構可以利用胰蛋白酶水解的方法除去，在除去VP1的G-H環(huán)結構后導致FMDV的毒力下降了許多[13-14]。

2012年Wang等[15]在研究VP1的G-H環(huán)結構對FMDV復制的影響時，在Asia 1型FMDV上G-H環(huán)狀結構中插入了O型FMDV的保護性中和表位，獲得的重組病毒具有誘導產生兩種血清型中和抗體的能力。同年Lawrence等[16]在VP1的G-H環(huán)結構上成功插入了一個Flag標簽(DYKDDDDK)。因為G-H環(huán)是一個柔性的環(huán)狀結構，為了最小限度地影響VP1的空間構型，Lawrence對插入Flag的序列進行了調整，將DKYDDDDK替換成DYKDDDDK。蝕斑實驗表明VP1插入標簽后FMDV的毒力下降。通過免疫熒光反應，檢測到Flag和VP1的表達。

Seago等[17]在2012年研究VP1 G-H環(huán)結構發(fā)生改變對FMDV特性影響時，在RGD下游即VP1的155–156位氨基酸中插入了HA和Flag標簽。含有標簽的重組病毒可以利用主要的整連蛋白受體，重組病毒的蝕斑與親本病毒相似，但毒力也存在一定程度的下降。VP1的G-H環(huán)狀結構的上游和下游均存在插入位點，用于表達外源片段。由于G-H環(huán)狀結構對FMDV比較重要，可能影響到病毒抗原性和吸附能力，所以此區(qū)域能接受外源片段的大小值得探索。

3 VP1區(qū)與2A蛋白區(qū)之間引入外源基因

FMDV的2A蛋白具有自我剪切功能。在FMDV復制的過程中，2A蛋白從C端開始將大部分的衣殼蛋白從非結構蛋白上切下，再由3C蛋白酶進一步對多聚蛋白進行水解。鑒于2A的特性，有學者一直嘗試利用這種特性在此位置進行反向遺傳操作。

2013年Seago等[18]在VP1區(qū)末端2A蛋白前，插入了大分子的標記熒光蛋白。其構建了2株重組病毒引入720 nt的綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 和933 nt的海腎熒光素酶 (Renilla luciferase，RL)。Seago等實驗的最初目的是在此區(qū)域表達GFP和RL，但是重組病毒感染山羊上皮細胞的結果顯示，3代以后細胞就不再出現病變了，也無法通過共聚焦觀察到GFP和RL的熒光。為了進一步研究此區(qū)域能接受外源基因的大小，Seago等在原位點處插入了外源片段構建了6株重組病毒 (外源片段大小依次為105 nt、204 nt、303 nt、417 nt、504 nt和609 nt)。實驗結果顯示插入外源片段小于300 nt的病毒能夠穩(wěn)定傳代并能從中檢測到插入基因，蝕斑實驗也顯示出了與親本病毒相近的毒力。這說明在此VP1末端和2A蛋白區(qū)之間，FMDV能夠容納較大的外源片段，這對FMD研究是一個新的突破。

4 3A蛋白區(qū)引入外源基因

FMDV與其他小RNA病毒不同，它有更長的3A蛋白。研究發(fā)現3A蛋白是使用物理方法與細胞內膜結合，但在FMDV感染細胞和復制的過程中3A非結構蛋白的功能并沒有被很好認識[19-20]。然而在3A蛋白發(fā)生變化時，這些變化都會導致宿主的特異性、適應性或毒力發(fā)生改變[21-23]。如Taiwan97毒株是因為3A92-102位氨基酸缺失導致對牛的致病性下降。2012年Li等[24]用Flag標簽和編碼單純性皰疹病毒 (HSV) D蛋白的抗原表位 (QPELAPEDPED)，替換了3A中第92～102位氨基酸，并且成功拯救出兩株重組口蹄疫病毒。實驗結果顯示重組病毒的毒力和復制動力學與原毒相近。經檢測發(fā)現在口蹄疫病毒3A處替換的FLAG與HSV抗原表位都能夠持續(xù)穩(wěn)定地表達。

5 3B蛋白區(qū)引入外源基因

FMDV具有3個相似但不完全相同的3B蛋白 (3B1-3) 或VPg (VPg1-3)，長度在23–24個氨基酸左右。FMDV 3B蛋白對病毒感染力影響不大，但分離的野毒都完整地保留了3B結構，這一結構有可能與FMDV進化過程中選擇壓力有密切關系[25]。也有實驗證明3B3是FMDV 3Dpol最有效的底物[26]。Falk和Pacheco[27-28]的研究表明，當FMDV存在3B3時才具有感染性，若僅有3B1或3B2則會導致病毒失活。2010年Arias等[29]在研究3B的缺失與突變與細胞病變關系時，構建了4株僅有單一3B拷貝的重組病毒，其中還包含2株由3B1和3B2重組的嵌合病毒 (圖2)。結果顯示不含3B3結構以及未保留3B3末端9 位氨基酸的2株重組病毒無法穩(wěn)定復制。這個實驗精確定位了3B3結構中對于FMDV復制有影響的氨基酸，從而證明3B3結構對于FMDV復制的重要性。

2010年Pacheco等[30]在研究3B與FMDV培養(yǎng)特性和對牛的致病性實驗中構建了5株重組病毒。其中3株是在3B1、3B2和3B3分別隨機地插入了19個氨基酸的序列，另外2株在保留了3B3后刪除了部分序列。5株重組病毒均拯救成功，然后對其毒力、復制能力以及各項生物學特性進行了檢測，最后與親本病毒進行比較，發(fā)現重組病毒的各項生物指標與親本病毒基本保持一致。2012年Uddowla等[31]在研究FMD負標記疫苗的時候，對FMDV全長cDNA克隆進行了多點突變和片段的缺失。其中包含在3B2的部分氨基酸進行缺失后替換，構建了多株重組病毒，并且成功拯救出了構建的FMDV。動物實驗發(fā)現構建的重組病毒并沒有產生穩(wěn)定的中和抗體，同時誘導的抗體沒有產生預期的交叉保護現象，但不同毒株誘導的抗體可以區(qū)分。

圖2 嵌合VPg的構建簡圖[27]Fig. 2 Schematic representation of the constructions with one copy of VPgs[27].

鑒于3B的特殊結構，這一區(qū)域一直是FMDV反向遺傳操作的區(qū)域。該區(qū)域作為FMDV載體的插入位點是值得深入研究的。作者所在團隊正在進行3B不同位置插入大片段基因的研究，如果突破將進一步推進FMDV表達插入基因大小的問題。

6 展望

FMDV基因序列上存在多個位點可以穩(wěn)定表達插入的外源基因，在利用反向遺傳學進行操作時，病毒的可控性很高。FMDV感染細胞時細胞病變快，復制滴度高，使得FMDV能夠高效表達外源基因。這兩點說明FMDV具有病毒載體的潛質。但FMD作為病毒載體面臨兩個問題：第一是毒株的安全性；第二是病毒能夠表達外源基因的大小。這兩點限制了口蹄疫病毒作為病毒載體的應用。

FMDV容易變異，這對FMD的防控十分不利，所以要將FMDV作為載體，穩(wěn)定的弱毒株是關鍵。目前許多學者都在嘗試將FMDV弱化，不僅能夠作為載體，如果毒株穩(wěn)定性強可以直接制成弱毒苗疫苗。致弱的FMDV載體是未來研究的一個熱點方向。有研究通過對病毒基因組進行改造在保證其活性的前提下降低其毒力，如L蛋白的SAP結構突變毒株，發(fā)現感染動物后無臨床癥狀也沒有排毒帶毒現象，并能產生有保護性的抗體[3,32-33]。目前我們實驗室利用反向遺傳技術已經成功構建了病毒滴度高、抗原匹配性好、免疫保護力強的疫苗株[34]。目前現階段有關FMDV表達外源基因的報道大都是小片段標記。Seago等[18]的研究為FMDV表達大的外源片段方面帶來了新的突破，但現階段關于FMDV作為載體插入大片段仍不成熟，尚不能在技術水平達到其他病毒載體的水平 (如：如腺病毒、桿狀病毒和痘病毒等)。因此FMDV基因組承載外源片段的能力也是FMDV研究的又一重點。

國內外一直致力于FMDV的研究，旨在有效控制FMD的流行。通過引入外源基因對FMDV進行改造可以解決很多現階段FMD防控的問題。如：我國控制FMD的主要手段是通過免疫滅活疫苗，由于在實際防控中FMD疫苗的多次免疫會造成感染抗體與疫苗免疫抗體難以區(qū)分的問題。我們在FMDV基因組引入標記，然后配套相關標記檢測試劑，在理論上是完全可以鑒別野毒感染抗體和免疫抗體。未來可以在FMDV中引入一些免疫因子的基因，如：樹突狀刺激因子的基因，這能改善免疫原性提高免疫效果。還借助FMDV的復制滴度高，在FMDV上引入外源基因進行高效表達。在FMD疫苗株上導入其他病原的主要抗原基因生產出雙價苗，能達到一苗防兩病的效果，同時簡化養(yǎng)殖場的免疫程序。

FMDV插入外源基因的研究是十分具有潛力的，無論是應用研究還是基礎研究都能使用到相關技術，這為FMDV研究提供了一個新思路。

REFERENCES

[1] Porter AG. Picornavirus nonstructural proteins: emerging roles in virus replication and inhibition of host cell functions. J Virol, 1993, 67(12): 6917-6921.

[2] Grubman MJ, Baxt B. Foot-and-mouth disease. Clin Microbiol Rev, 2004, 17(2): 465-493.

[3] De los Santos T, Segundo FD, Zhu J, et al. A conserved domain in the leader proteinase of foot-and-mouth disease virus is required for proper subcellular localization and function. J Virol, 2009, 83(4): 1800-1810.

[4] Piccone ME, Rieder E, PETER Mason PW, et al. The foot-and-mouth disease virus leader proteinase gene is not required for viral replication. J Virol, 1995, 69(9): 5376-5382.

[5] Brown CC, Piccone ME, Mason PW, et al. Pathogenesis of wild-type and leaderless foot-and-mouth disease virus in cattle. J Virol, 1996, 70(8): 5638-5641.

[6] Piccone ME, Pacheco JM, Pauszek SJ, et al. The region between the two polyprotein initiation codons of foot-and-mouth disease virus is critical for virulence in cattle. Virology, 2010, 396(1): 152-159.

[7] Piccone ME, Diaz-San Segundo F, Kramer E, et al. Introduction of tag epitopes in the inter-AUG region of foot and mouth disease virus: effect on the L protein. Virus Res, 2011, 155(1): 91-97.

[8] Baxt B, Becker Y. The effect of peptides containing the arginine-glycine-aspartic acid sequence on the adsorption of foot-and-mouth disease virus to tissue culture cells. Virus Genes, 1990, 4(1): 73-83.

[9] Brown F, Benkirane N, Limal D, et al. Delineation of a neutralizing subregion within the immunodominant epitope (GH loop) of foot-and-mouth disease virus VP1 which does not contain the RGD motif. Vaccine, 1999, 18(1/2): 50-56.

[10] Burman A, Clark S, Abrescia NG, et al. Specificity of the VP1 GH loop of Foot-and-Mouth Disease virus for alphav integrins. J Virol, 2006, 80(19): 9798-9810.

[11] Fox G, Parry NR, Barnett PV, et al. The cell attachment site on foot-and-mouth disease virus includes the amino acid sequence RGD (arginine-glycine-aspartic acid). J Gen Virol, 1989, 70 (Pt 3): 625-637.

[12] Acharya R, Fry E, Stuart D, et al. The three-dimensional structure of foot-and-mouth disease virus at 2.9 A resolution. Nature, 1989, 337(6209): 709-716.

[13] Aggarwal N, Barnett PV. Antigenic sites of foot-and-mouth disease virus (FMDV): an analysis of the specificities of anti-FMDV antibodies after vaccination of naturally susceptible host species. J Gen Virol, 2002, 83(Pt 4): 775-782.

[14] Strohmaier K, Franze R, Adam KH. Location and characterization of the antigenic portion of the FMDV immunizing protein. J Gen Virol, 1982, 59(Pt 2): 295-306.

[15] Wang H, Xue M, Yang D, et al. Insertion of typeO-conserved neutralizing epitope into the foot-and-mouth disease virus type Asia1 VP1 G-H loop: effect on viral replication and neutralization phenotype. J Gen Virol, 2012, 93(Pt 7): 1442-1448.

[16] Lawrence P, Pacheco JM, Uddowla S, et al. Foot-and-mouth disease virus (FMDV) with a stable FLAG epitope in the VP1 G-H loop as a new tool for studying FMDV pathogenesis. Virology, 2013, 436(1):150-161.

[17] Seago J, Jackson T, Doel C, et al. Characterization of epitope-tagged foot-and-mouth disease virus. J Gen Virol, 2012, 93(Pt 11): 2371-2381.

[18] Seago J, Juleff N, Moffat K, et al. An infectious recombinant foot-and-mouth disease virus expressing a fluorescent marker protein. J Gen Virol, 2013, 94(Pt 7): 1517-1527.

[19] Schlegel A, Giddings TH Jr, Ladinsky MS, et al. Cellular origin and ultrastructure of membranes induced during poliovirus infection. J Virol, 1996, 70(10): 6576-6588.

[20] Towner JS, Ho TV, Semler BL. Determinants of membrane association for poliovirus protein 3AB. J Biol Chem, 1996, 271(43): 26810-26818.

[21] Giraudo AT, Beck E, Strebel K, et al. Identification of a nucleotide deletion in parts of polypeptide 3A in two independent attenuated aphthovirus strains. Virology, 1990, 177(2): 780-783.

[22] Beard CW, Mason PW. Genetic determinants of altered virulence of Taiwanese foot-and-mouth disease virus. J Virol, 2000, 74(2): 987-991.

[23] Knowles NJ, Davies PR, Henry T, et al. Emergence in Asia of foot-and-mouth disease viruses with altered host range: characterization of alterations in the 3A protein. J Virol, 2001, 75(3): 1551-1556.

[24] Li P, Bai X, Cao Y, et al. Expression and stability of foreign epitopes introduced into 3A nonstructural protein of foot-and-mouth disease virus. PLoS ONE, 2012, 7(7): e41486.

[25] Carrillo C, Lu Z, Borca MV, et al. Genetic and phenotypic variation of foot-and-mouth disease virus during serial passages in a natural host. J Virol, 2007, 81(20): 11341-11351.

[26] Nayak A, Goodfellow IG, Belsham GJ. Factors required for the Uridylylation of the foot-and-mouth disease virus 3B1, 3B2, and 3B3 peptides by the RNA-dependent RNA polymerase (3Dpol) in vitro. J Virol, 2005, 79(12): 7698-7706.

[27] Falk MM, Sobrino F, Beck E. VPg gene amplification correlates with infective particle formation in foot-and-mouth disease virus. J Virol, 1992, 66(4): 2251-2260.

[28] Pacheco JM, Henry TM, O'Donnell VK, et al. Role of nonstructural proteins 3A and 3B in host range and pathogenicity of foot-and-mouth disease virus. J Virol, 2003, 77(24): 13017-13027.

[29] Arias A, Perales C, Escarmís C, et al. Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus. PLoS ONE, 2010, 5(5): e10735.

[30] Pacheco JM, Piccone ME, Rieder E, et al. Domain disruptions of individual 3B proteins of foot-and-mouth disease virus do not alter growth in cell culture or virulence in cattle. Virology, 2010, 405(1): 149-156.

[31] Uddowla S, Hollister J, Pacheco JM, et al. A safe foot-and-mouth disease vaccine platform with two negative markers for differentiating infected from vaccinated animals. J Virol, 2012, 86(21): 11675-11685.

[32] Aravind L, Koonin EV. SAP-a putative DNA-binding motif involved in chromosomal organization. Trends Biochem Sci, 2000, 25(3): 112-114.

[33] Segundo FD, Weiss M, Pérez-Martín E, et al. Inoculation of swine with foot-and-mouth disease SAP-mutant virus induces early protection against disease. J Virol, 2012, 86(3): 1316-1327.

[34] Zheng H, Guo J, Jin Y, et al. Engineering foot-and-mouth disease viruses with improved growth properties for vaccine development. PLoS ONE, 2013, 8(1): e55228.

(本文責編 陳宏宇)

Progress in insertion sites for foreign sequence of foot and mouth disease virus

Yan Zhang1, Yonghao Hu1, Fan Yang2, and Haixue Zheng2
1 College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China 2 National Foot and Mouth Disease Reference Laboratory, State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, Gansu, China

With the progess in studying gene structure and function of foot and mouth disease virus (FMDV), FMDV canexpress exogenous genes in different sites. Through transforming and modifying FMDV can achieve different application purposes such as improving virus titer, introducing tag, improving immune responses, and reducing pathogenicity. From the perspective of FMDV receiving inserted exogenous gene, this paper mainly describes the latest relevant developments of FMDV’s expression to exogenous gene.

foot and mouth disease virus, exogenous gene, insertion site

May 2, 2013; Accepted: July 16, 2013

Yonghao Hu. Tel/Fax: +86-931-7631220; E-mail: yhh0817@126.com Haixue Zheng. Tel/Fax: +86-931-8342086; E-mail: haixuezheng@163.com

張巖, 胡永浩, 楊帆, 等. 口蹄疫病毒外源序列插入位點的研究進展. 生物工程學報, 2014, 30(2): 175-181.

ZhangY, Hu YH, Yang F, et al. Progress in insertion sites for foreign sequence of foot and mouth disease virus. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 175-181.

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA10A211-1), the High-level Technological Talent Program of Gansu Province (No. 1013JHTA008), the International Atomic Energy Agency (No. 16025/R0), China Agriculture Research System (No. CARS-39).

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2011AA10A211-1)，甘肅省高層次人才科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)扶持行動項目 (No. 1013JHTA008)，

國際原子能機構項目 (No. 16025/R0)，中國農業(yè)產業(yè)體系 (No. CARS-39) 資助。

時間: 2013-08-16 網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20130816.1711.002.html