孜力汗，劉晨光，白鳳武大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

廢糟液全循環(huán)條件下絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵

孜力汗，劉晨光，白鳳武
大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

丙酸是以玉米為原料自絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)廢糟液全循環(huán)過程中積累的主要抑制物?；诒釋?duì)酵母細(xì)胞抑制機(jī)理，開發(fā)了3種廢糟液全循環(huán)條件下乙醇連續(xù)發(fā)酵工藝策略。首先根據(jù)高溫導(dǎo)致丙酸生成的現(xiàn)象，去除了物料滅菌環(huán)節(jié)，使發(fā)酵液丙酸濃度顯著降低，生物量和乙醇濃度分別提高了59.3%和7.4%。其次，以丙酸濃度達(dá)到半數(shù)抑制濃度（IC50）40 mmol/L為目標(biāo)，通過擬合丙酸積累數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)廢糟液全循環(huán)的最長(zhǎng)運(yùn)行時(shí)間，發(fā)酵裝置運(yùn)行應(yīng)控制在此時(shí)間范圍內(nèi)。再次，較低的環(huán)境pH值提高了丙酸毒性，而實(shí)驗(yàn)證明發(fā)酵液pH為5.5時(shí)，丙酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制影響最小，因此控制發(fā)酵過程中的pH有利于弱化丙酸毒性。

自絮凝酵母，乙醇連續(xù)發(fā)酵，廢糟液全循環(huán)，丙酸抑制

我國(guó)“十五”期間開始發(fā)展燃料乙醇，先后在黑、吉、皖、豫和桂五省區(qū)建設(shè)了大型生產(chǎn)裝置，但自投產(chǎn)以來都依賴國(guó)家財(cái)政補(bǔ)貼運(yùn)行。截止到2012年底國(guó)家的直接財(cái)政補(bǔ)貼已經(jīng)超過100億。目前糖質(zhì)和淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)的燃料乙醇占市場(chǎng)總量的90%以上，生產(chǎn)成本主要來自原料和能耗[1-2]，其中能耗主要來自發(fā)酵液精餾和廢糟液處理過程，特別是常用的廢糟液離心后上清液多效蒸發(fā)濃縮技術(shù)[3]。因此，廢糟液循環(huán)利用是降低其處理能耗最有效的策略。

自絮凝酵母乙醇發(fā)酵可以在發(fā)酵結(jié)束后通過沉降的方式將酵母從發(fā)酵液中分離，顯著降低精餾過程產(chǎn)生廢糟液的COD，為大比例乃至全循環(huán)廢糟液創(chuàng)造了良好條件[4]。然而在廢糟糟液全循環(huán)過程中，高沸點(diǎn)副產(chǎn)物會(huì)在系統(tǒng)中積累，對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵產(chǎn)生影響[5-6]。丙酸被認(rèn)為是主要的抑制物[7]，主要來自于原料液化、培養(yǎng)基滅菌和發(fā)酵液蒸餾等高溫環(huán)節(jié)[8-9]。

丙酸對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響與其他有機(jī)酸類似。在pH值較低的條件下，多以未解離形態(tài)存在，較容易透過脂質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。在胞內(nèi)pH接近中性環(huán)境下，有機(jī)酸解離釋放出質(zhì)子，造成胞質(zhì)酸化而使細(xì)胞死亡[10-11]。因此濃度和環(huán)境pH值是影響丙酸對(duì)酵母細(xì)胞毒性的關(guān)鍵因素。本文針對(duì)丙酸的抑制機(jī)理，通過實(shí)驗(yàn)研究開發(fā)了3種廢糟液全循環(huán)絮凝酵母乙醇發(fā)酵策略，為該工藝的工業(yè)化生產(chǎn)和穩(wěn)定運(yùn)行提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株和原料

自絮凝釀酒酵母(SPSC01)由中國(guó)微生物保藏中心保存，菌株號(hào)為0587[12]。玉米粉由中糧生化能源 (肇東) 有限公司贈(zèng)送；液化酶和糖化酶由諾維信 (中國(guó)) 公司贈(zèng)送。

1.2 培養(yǎng)基與發(fā)酵

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉4 g/L，蛋白胨3 g/L，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米糖化液還原糖濃度約為220 g/L，(NH4)2HPO42.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。玉米糖化液的制備采用雙酶法水解玉米粉[13]。

將種子培養(yǎng)液靜置后棄去上清液，加入100 mL 滅好菌的100 mmol/L 檸檬酸鈉溶液使絮凝酵母解絮以控制接種量，將解絮后的酵母種子按照5% (V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.3 丙酸影響實(shí)驗(yàn)

以無添加為對(duì)照，將丙酸分別按照10、20、30、40、50和60 mmol/L的濃度添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為4.5，溫度30 ℃，攪拌速率150 r/min，發(fā)酵36 h后檢測(cè)乙醇、殘?zhí)?、生物量濃度?/p>

通過丙酸對(duì)酵母生長(zhǎng)的抑制率 (y) 來評(píng)價(jià)丙酸對(duì)酵母乙醇發(fā)酵的影響，計(jì)算公式如下：

其中x0和xi分別為對(duì)照組和丙酸添加組對(duì)應(yīng)的菌體生物量，g (DCW)/L。

1.4 廢糟液全循環(huán)條件下絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵

在有效體積為1.5 L的攪拌式反應(yīng)器中，種子擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)束后以稀釋速率0.04 h-1流加發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，溫度30 ℃，pH 4.2–4.5，攪拌速率150 r/min，通氣量0.05 vvm。每隔3天將收集到的發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，得到的廢糟液全部用于玉米粉調(diào)漿制備糖化液。玉米糖化液制備好后進(jìn)行過濾，清液稀釋至發(fā)酵所需還原糖濃度，并加入相應(yīng)濃度營(yíng)養(yǎng)鹽配制成發(fā)酵培養(yǎng)基[14]。

1.5 分析方法

乙醇和甘油濃度用Waters高效液相色譜測(cè)定[15]。還原糖采用二硝基水楊酸法測(cè)定[16]。生物量測(cè)量采用干重法[17]。丙酸和乳酸采用Dionex ICS-2500離子色譜系統(tǒng)分析[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酸的來源及毒性

前期工作已經(jīng)證明，丙酸是廢糟液全循環(huán)乙醇連續(xù)發(fā)酵過程積累的主要抑制物，主要來源于原料高溫處理過程。玉米粉中主要來自籽皮的半纖維素組分水解產(chǎn)生的戊糖及其衍生物在高溫作用下分解產(chǎn)生丙酸[19]。因此，高溫滅菌和蒸餾環(huán)節(jié)是丙酸的主要來源[7]。

隨著丙酸濃度的增加，對(duì)酵母生長(zhǎng)的抑制逐漸明顯 (圖1)。丙酸濃度為40 mmol/L時(shí)對(duì)酵母生長(zhǎng)的抑制達(dá)到約50%，因此其半數(shù)抑制濃度(IC50) 約為40 mmol/L。降低丙酸濃度可以有效弱化其對(duì)酵母細(xì)胞的抑制作用。

圖1 丙酸對(duì)絮凝酵母生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effect of propionic acid on the growth of the flocculating yeast.

2.2 策略1：減少高溫處理環(huán)節(jié)

高溫有利于副產(chǎn)丙酸[7,20]，因此避免過程高溫操作環(huán)節(jié)可以減少丙酸生成。在乙醇發(fā)酵過程中，原料液化、糖化、滅菌和發(fā)酵液蒸餾都需要較高溫度，而滅菌又是溫度最高的環(huán)節(jié)。在滿足生產(chǎn)要求的前提下，去除發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌環(huán)節(jié)可以減少丙酸生成，改善乙醇發(fā)酵過程。

發(fā)酵培養(yǎng)基不經(jīng)高溫滅菌直接進(jìn)行乙醇連續(xù)發(fā)酵，使得廢糟液循環(huán)條件下丙酸積累量顯著降低 (圖2)，生物量積累升高了59.3%，乙醇濃度升高了7.4%，殘?zhí)菨舛冉档土?0.1% (表1)。測(cè)定乳酸濃度來評(píng)價(jià)發(fā)酵過程雜菌污染情況[21]，培養(yǎng)基不滅菌條件下發(fā)酵液乳酸含量有所增高，但總量依然較低，且經(jīng)過顯微鏡鏡檢未發(fā)現(xiàn)大量雜菌。雖然糖醇轉(zhuǎn)化率稍有降低，但仍然可以滿足發(fā)酵需求。更重要的是，由于降低了主要抑制物丙酸的影響，發(fā)酵過程平均乙醇濃度是增高的。

乙醇工業(yè)生產(chǎn)過程中，醪液經(jīng)高溫液化后進(jìn)行預(yù)糖化，然后直接進(jìn)入發(fā)酵罐，進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。液化溫度對(duì)大多數(shù)微生物都有殺滅作用，而酵母作為優(yōu)勢(shì)菌種、發(fā)酵罐中的低pH環(huán)境以及生成的乙醇可以有效抑制細(xì)菌繁殖，因此醪液不滅菌處理在乙醇發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)中普遍使用。

2.3 策略2：控制裝置運(yùn)行時(shí)間

雖然去除了滅菌環(huán)節(jié)使得丙酸生成量顯著降低，但由于酵母不代謝丙酸且丙酸沸點(diǎn)高不易揮發(fā)，隨著廢糟液全循環(huán)乙醇連續(xù)發(fā)酵長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行得到積累。了解丙酸積累規(guī)律，并控制廢糟液循環(huán)時(shí)間，可以使丙酸積累對(duì)酵母細(xì)胞的影響維持在較低水平。

圖2 廢糟液全循環(huán)乙醇連續(xù)發(fā)酵過程丙酸積累Fig. 2 Propionic acid accumulation during ethanol fermentation by the flocculating yeast under the stillage backset condition.

表1 培養(yǎng)基高溫滅菌和不經(jīng)高溫滅菌條件下廢糟液全循環(huán)乙醇連續(xù)發(fā)酵過程主要工藝技術(shù)指標(biāo)Table 1 Biomass, ethanol, residual sugars and lactic acid detected during continuous ethanol fermentation by the flocculating yeast under the stillage backset and medium with/without sterilization conditions

如圖2可以看出，培養(yǎng)基滅菌條件下丙酸積累較明顯。通過擬合并獲得了丙酸隨廢糟液循環(huán)時(shí)間積累的方程為：

Y為丙酸濃度 (mg/L)，X為發(fā)酵裝置運(yùn)行時(shí)間 (h)。設(shè)定丙酸濃度不超過IC50(40 mmol/L)，按上述公式計(jì)算丙酸達(dá)到IC50時(shí)發(fā)酵裝置運(yùn)行時(shí)間分別為28 d (675.8 h) 和38 d (908.7 h)。因此減少高溫滅菌環(huán)節(jié)使得發(fā)酵裝置運(yùn)行時(shí)間顯著延長(zhǎng)。

2.4 策略3：控制發(fā)酵過程pH值

丙酸作為一種有機(jī)酸，其對(duì)酵母細(xì)胞的毒性與環(huán)境pH值密切相關(guān)。圖3所示為環(huán)境pH值對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響。

發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別調(diào)節(jié)至3.0、4.0、4.5和5.5。在相同pH值條件下，丙酸濃度的增加對(duì)酵母生長(zhǎng)的抑制增強(qiáng)。當(dāng)丙酸濃度小于30 mmol/L時(shí)，不同pH值對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響幾乎無差異。當(dāng)丙酸濃度大于IC50時(shí)，pH值減小，增加了丙酸的抑制效果。由于丙酸的pKa為4.87，當(dāng)環(huán)境pH低于該值時(shí)，丙酸多以未解離形式存在并較容易進(jìn)入細(xì)胞對(duì)酵母產(chǎn)生毒性。培養(yǎng)基pH 5.5大于丙酸pKa值，使得未解離形式丙酸量大大降低，因此控制發(fā)酵液pH在5.5比較合適。

圖3 pH值和丙酸濃度對(duì)絮凝酵母生長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effect of propionic acid and pH on yeast growth.

3 結(jié)論與展望

基于丙酸對(duì)酵母細(xì)胞抑制機(jī)理，提出了3種廢糟液全循環(huán)條件下乙醇連續(xù)發(fā)酵的工藝策略。首先在滿足乙醇生產(chǎn)要求的前提下，通過去除原料滅菌環(huán)節(jié)使丙酸的生成顯著降低；其次通過控制發(fā)酵裝置運(yùn)行時(shí)間避免丙酸濃度超過IC50；再次，環(huán)境pH對(duì)丙酸的細(xì)胞毒性有重要作用，控制發(fā)酵液pH值5.5顯著弱化丙酸對(duì)酵母細(xì)胞的毒性。以上3種方法可以單獨(dú)使用，也可以同時(shí)應(yīng)用以達(dá)到更好效果。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Process development for continuous ethanol fermentation by the flocculating yeast under stillage backset conditions

Lihan Zi, Chenguang Liu, and Fengwu Bai
School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China

Propionic acid, a major inhibitor to yeast cells, was accumulated during continuous ethanol fermentation from corn meal hydrolysate by the flocculating yeast under stillage backset conditions. Based on its inhibition mechanism in yeast cells, strategies were developed for alleviating this effect. Firstly, high temperature processes such as medium sterilization generated more propionic acid, which should be avoided. Propionic acid was reduced significantly during ethanol fermentation without medium sterilization, and concentrations of biomass and ethanol increased by 59.3% and 7.4%, respectively. Secondly, the running time of stillage backset should be controlled so that propionic acid accumulated would be lower than its half inhibition concentration IC50(40 mmol/L). Finally, because low pH augmented propionic acid inhibition in yeast cells, a higher pH of 5.5 was validated to be suitable for ethanol fermentation under the stillage backset condition.

self-flocculating yeast, continuous ethanol fermentation, stillage backset, propionic acid inhibition

May 14, 2013; Accepted: July 1, 2013

Fengwu Bai. Tel: +86-411-84706308; Fax: +86- 411-84706329; E-mail: fwbai@dlut.edu.cn

孜力汗, 劉晨光, 白鳳武. 廢糟液全循環(huán)條件下絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(2): 310-314.

Zi LH, Liu CG, Bai FW. Process development for continuous ethanol fermentation by the flocculating yeast under stillage backset conditions. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 310-314.

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA021205), International S&T Cooperation Program of China (No. 2013DFA60470).

國(guó)家高科技研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2012AA021205)，國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng) (No. 2013DFA60470) 資助。