趙玄多，徐素慧，楊雯昱，高 洋，修云芳，陳玉村，陳德坤＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.海峽（福州）大熊貓研究交流中心，福建福州350001）

白介素17（IL-17）最早是由Rouvier E 等［1］從鼠活化的T 細胞克隆出的細胞因子，起初被命名為CTLA-8，2年后研究揭示其受體是一種新的細胞因子受體IL-17R，故而CTLA-8被重新命名為IL-17。Lubberts E等［2］的研究結(jié)果提示，IL-17可能是一種在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的細胞因子。近年來的大量研究資料顯示，IL-17不僅在機體自身免疫疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵的炎癥介導(dǎo)者的作用，通過其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對機體自身正常組織細胞造成嚴重的免疫病理損傷，而且該細胞因子也在機體抗病原微生物感染中起著集中地作用，通過其介導(dǎo)的炎性作用募集大量的免疫細胞至炎性部位清除病原微生物［3-6］。

IL-17在機體免疫反應(yīng)的作用已被許多醫(yī)學(xué)研究人員所關(guān)注，其在動物免疫性疾病及抗感染中的作用研究已經(jīng)有文獻報道［7］，牛、山羊、大熊貓、雞和鴨等許多物種的IL-17均被克隆，但小熊貓IL-17的研究未見報道。本研究通過小熊貓IL-17 基因克隆，對其保守序列和特異序列進行了分析，并獲得了原核表達蛋白，為進一步探討其在小熊貓炎癥反應(yīng)中的作用等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和細胞 原核表達載體PET-32a、BL21（DE3）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)免疫學(xué)實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 TaKaRa rTaqDNAploymerase、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、T4DNA 連接酶、DNA MarkerⅠ、DNA 標準DL 5 000、RNA 提取試劑盒、AMV Reverse Transcriptase、高分子量蛋白質(zhì)分子量標準，均購自寶生物工程（大連）有限公司；Blue PlusⅡProtein Marker，購自全式金生物技術(shù)有限公司；San Prep柱式DNA 膠回收試劑盒、San Prep柱式DNA 小量抽提試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 cDNA 的合成 采健康小熊貓抗凝血5 mL，用完全1640培養(yǎng)基培養(yǎng)分離到的淋巴細胞，經(jīng)20μg／mL conA 刺激培養(yǎng)淋巴細胞24h 后，用RNA 提取試劑盒提取淋巴細胞總RNA，并依據(jù)說明書AMV Reverse Transcriptase操作反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 小熊貓IL-17基因CDS區(qū)的克隆依據(jù)NCBI 公布的大熊貓IL-17（序列號為：XM-002915419.1）CDS 區(qū)序列在primer 5.0 上設(shè)計引物如下，F(xiàn)：5′-ATGGCTCCTGTGACAACTT-3′，R：5′-AACACGCGGTACACCGAATT -3′。引 物在南京金斯瑞生物科技公司合成。用r-TaqDNA ploymerase進行擴增，擴增體系為10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture（2.5 mmol／L）2μL，rTaqDNA ploymerase 0.25μL，上、下游引物各0.5μL，cDNA 模板1μL，滅菌蒸餾水16.25μL，氯化鎂2 μL，總體積25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94 ℃50s，53 ℃35s，72 ℃50s，30個循環(huán)；72 ℃10min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。預(yù)計片段大小為462bp。取全部PCR 產(chǎn)物于10g／L 瓊脂凝膠電泳，然后按照DNA 膠回收試劑盒說明書回收PCR 產(chǎn)物，送南京金斯瑞生物科技公司測序。

1.2.3 重組載體的構(gòu)建與鑒定 依據(jù)測序所得的小熊貓IL-17序列（序列號為：KJ461927），用Singal 4.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）預(yù)測信號肽，以去掉信號肽的序列為模板設(shè)計引物為F：5′-CGCGGATCCGGAATAGCATTTCCACAAAAT -3′（引入BamHⅠ酶切位點），R：5′-CCCAAGCTTTTAAGCCACATGGCGCACAAT-3′（引 入Hind Ⅲ酶 切位點），引物在南京金斯瑞生物科技公司合成。用r-TaqDNAploymerase進行擴增，擴增體系為10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture（2.5mmol／L）2μL，r-TaqDNA ploymerase 0.25μL，上、下游引物各0.5 μL，“1.2.2”中PCR回收產(chǎn)物1μL，滅菌蒸餾水16.25 μL，氯化鎂2μL，總體積25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃50s，54 ℃45s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。預(yù)計片段大小為393bp。取全部PCR 產(chǎn)物于10g／L瓊脂凝膠電泳，然后按照DNA 膠回收試劑盒說明書回收PCR 產(chǎn)物。將膠回收產(chǎn)物和pET-32a用BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化至BL-21（DE3）感受態(tài)細胞中，從LB／Amp＋平板中挑取單克隆，經(jīng)質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定的陽性菌株測序。

1.2.4 基因誘導(dǎo)表達和蛋白純化 將表達菌在不同的IPTG 濃度、溫度、時間下誘導(dǎo)，取一定量的菌液經(jīng)12 000r／min離心2min后，用PBS洗滌3次，用1／10體積的PBS 溶解，在冰上超聲破碎菌液至澄清（40 W，每次 超聲2 min，間隔2s），12 000 r／min離心2min后取上清并用等體積的PBS溶解沉淀，SDS-PAGE觀察表達效果，確定IL-17的最佳表達條件。根據(jù)最佳表達條件大量誘導(dǎo)菌液，并用鎳柱法進行蛋白純化。

1.2.5 IL-17基因分析 在NCBI上查找其他物種的IL-17基因序列，并用MEGA5.0構(gòu)建進化樹，分析IL-17在進化上與其他物種的親緣關(guān)系。在CBS上分析（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetNG-lyc／）N-Gly位點。用Clustal W 比對氨基酸序列與小熊貓IL-17序列的相似性。相關(guān)物種的基因序列號如下：牛（NM-001008412.2），雞（AY744450.1），狗（NM-001165878.1），大熊貓（XM-002915419.1），山羊（NM-001285725.1），豚鼠（JQ315117.1），鼠（U43088.1），馬（NM-001143792.1），人（U32659.1），海象（XM-004415641.1），豬（FJ196861.1），狨猴（EF534212）。

2 結(jié) 果

2.1 小熊貓IL-17基因的克隆

取cDNA PCR 產(chǎn)物于10g／L 的瓊脂凝膠電泳檢測，可以觀察到一條約500bp的片段，與預(yù)測結(jié)果相符（圖1）。

圖1 PCR 擴增IL-17基因Fig.1 PCR amplification of IL-17

2.2 原核重組質(zhì)粒鑒定

將篩選出的菌落經(jīng)質(zhì)粒雙酶切和PCR鑒定，均獲得了預(yù)期的目的條帶，表明目的基因已經(jīng)插入到載體中，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒（圖2和圖3）。

圖2 pET32a-IL-17 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET32a-IL-17 by double enzyme digestion

2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達和蛋白純化

圖3 pET32a-IL-17重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.3 PCR identification of recombinant plasmid pET32a-IL-17

分別以0.2、0.5、0.7mmol／L 的IPTG 濃度，分別在37℃、35℃、30℃、25℃、20℃、16℃下進行小熊貓IL-17的誘導(dǎo)表達。不同時間段取樣進行SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示，上清中最優(yōu)表達條為25 ℃、0.5mmol／L IPTG 誘導(dǎo)20h，表達產(chǎn)物在電泳圖譜上約為32.2ku。經(jīng)鎳柱法純化表達產(chǎn)物（圖4、圖5）。

圖4 重組pET32a-IL-17-BL-21上清最適條件下的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of supernatants in the best expression of recombinant pET32a-IL-17-BL-21

圖5 IL-17 純化的SDS-PAGE結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified IL-17protein

2.4 小熊貓IL-17的序列及基因進化分析

用MEGA.5.0分析并建立進化樹（圖6），發(fā)現(xiàn)在進化關(guān)系上小熊貓IL-17與大熊貓IL-17最為接近，而與雞IL-17最為疏遠；相似性比較，發(fā)現(xiàn)與大熊貓IL-17相似度達到了93.7%，而與雞IL-17相似性僅為50%（圖7）。利用CBS預(yù)測器預(yù)測N-G和磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)具有6個保守的半胱氨酸殘基和CXC趨化因子結(jié)合位點，在NRST 序列的N 上具有糖基化現(xiàn)象（圖8）。以上結(jié)果表明小熊貓IL-17具有IL-17分子的特異性結(jié)構(gòu)和化學(xué)基團修飾，同時與種屬相近的物種保持較高的序列相似性。

3 討 論

作為珍稀野生動物，小熊貓的人工飼養(yǎng)技術(shù)并不像大熊貓那樣成熟和完善，許多動物園的小熊貓在引進后會因應(yīng)激導(dǎo)致免疫力下降而死亡一部分，剩余的小熊貓在飼養(yǎng)過程中因感染而陸續(xù)發(fā)病死亡［8-9］。剖檢發(fā)現(xiàn)，死亡小熊貓多種臟器呈較為嚴重的炎性反應(yīng)特征，這一現(xiàn)象較為普遍［9-11］，但其病理學(xué)分子機制至今不清楚。IL-17分子的最新研究結(jié)果表明，IL-17是眾多炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介導(dǎo)者，無論是抗感染免疫炎癥反應(yīng)還是自身免疫病炎癥反應(yīng)，都離不開IL-17的介導(dǎo)［12-13］。適當(dāng)?shù)卣{(diào)控炎癥反應(yīng)強度不僅有利于機體迅速清除體內(nèi)的病原微生物，也能減小因炎癥反應(yīng)過強而引起的對自身細胞組織的損傷。與目前臨床使用的多種免疫調(diào)節(jié)藥物相比，IL-17分子將有可能成為解決這一問題的突破口。本研究所獲得的小熊貓IL-17重組蛋白，將為下一步制備IL-17抗體、人工調(diào)控小熊貓免疫反應(yīng)強度、檢測小熊貓體內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)強度提供新的手段和方法。本研究克隆得到的小熊貓IL-17基

因CDS區(qū)由462bp組成，編碼的多肽含23個氨基酸組成的信號肽，成熟的IL-17蛋白由130個氨基酸組成。經(jīng)過對小熊貓IL-17氨基酸分子序列分析發(fā)現(xiàn)，它具有6個保守的半胱氨酸殘基和和兩個保守序列，其中一個含有CXC序列，在NRST 的N 上具有糖基化，在進化關(guān)系上與大熊貓最為相近。說明小熊貓IL-17分子的空間構(gòu)型和生物學(xué)活性與其他動物IL-17的基本相似。但是在對于其他物種在84位點保守的脯氨酸（P）和在115位點保守的谷氨酰胺（Q），在小熊貓氨基酸卻替換為T 蘇氨酸和R精氨酸。通過變換各種試驗條件，找出一組最佳的誘導(dǎo)表達條件，在該條件下誘導(dǎo)重組菌可獲得小熊貓IL-17的可溶性表達產(chǎn)物。表達產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化后，SDS-PAGE 顯示其分子質(zhì)量約32ku。上述研究結(jié)果為進一步制備相應(yīng)抗體、研制小熊貓IL-17免疫檢測試劑盒、研究小熊貓IL-17原核表達產(chǎn)物免疫活性及其臨床應(yīng)用等工作打下了堅實的基礎(chǔ)。

圖6 小熊貓IL-17基因進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of Red panda IL-17gene

圖7 小熊貓IL-17基因核苷酸序列同源性分析Fig.7 Homology analysis of IL-17gene nucleotide of Red panda

圖8 小熊貓IL-17氨基酸序列分析結(jié)果Fig.8 Analysis of IL-17amino acid sequence of Red panda

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