唐漢慶，勞傳君，李曉華，朱曉瑩，李克明

（右江民族醫(yī)學院，廣西百色533000）

慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease，COPD）的發(fā)生發(fā)展與機體氧化-抗氧化失衡有關(guān)。已有臨床文獻報道，N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）可以改善肺功能，減少病情加重次數(shù)，縮短加重期病程，延緩疾病的進展速度，因此，NAC在COPD 抗氧化治療中具有重要作用［1-2］。NAC 含有促進還原型谷胱甘肽（GSH）生物合成的半胱氨酸，是一種抗氧化劑，對體內(nèi)氧自由基具有顯著的拮抗作用。本研究建立COPD 大鼠模型，以NAC為干預藥物，觀察與氧化-抗氧化系統(tǒng)密切相關(guān)的血管活性物質(zhì)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、活性氧（ROS）、內(nèi)皮素（ET）、一氧化氮（NO）及肺組織核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）的變化，從NAC 抗氧化作用角度探討其對COPD 治療的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級Wistar大鼠100只，雌雄各半，體重280g～320g，本院科學實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（桂）2012-0002。

1.1.2 藥物與試劑NAC批號P120326，為美國Sigma公司產(chǎn)品；AngⅡ試劑盒批號201311，NO 試劑盒批號201306，ET試劑盒批號230611，NF-κB試劑盒批號120674，ROS試劑盒批號031045，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；MDA試劑盒批號20132501，為東亞免疫技術(shù)研究所產(chǎn)品；SOD 試劑盒批號012302，為深圳晶美生物工程公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器電子天平，AE160型，為瑞士Mettler公司產(chǎn)品；酶標儀，AD340型，為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；生物顯微鏡，DMIL LED 型，為萊卡公司產(chǎn)品；分光光度計，722型，為上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；γ放射免疫計數(shù)器，F(xiàn)J-2021型，為廣州飛迪公司產(chǎn)品；臺式高速低溫離心機，Z360K型，為德國HERMLE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和處理 適應性飼養(yǎng)7d后，隨機分成對照組，模型組，NAC低、中、高劑量組共5組，每組20只。模型組造模方法：參考文獻報道［3-4］，大鼠在室溫環(huán)境下，第1、8、15、23 天大鼠麻醉后氣管內(nèi)滴脂多糖（LPS），將大鼠逐一稱重，按50 mg／kg體重腹腔注射（ip）濃度為4g／L 戊巴比妥鈉溶液，待大鼠麻醉后，將其固定于解剖臺上，頭低位暴露聲門，將16 號靜脈套管針沿氣管走行快速插入氣管，拔出針芯，接1 mL 注射器，1s內(nèi)注入溶于注射用生理鹽水的濃度為1mg／mL 的LPS 0.2mL（200 μg），將大鼠直立，左右旋轉(zhuǎn)，使LPS在肺內(nèi)均勻分布。第2天～第16 天給予大鼠每天2 次香煙煙熏，每次點燃煙絲的重量為9.03g（每支煙煙絲重量為0.645g），持續(xù)時間1h，間隔4h（滴LPS當天不煙熏）。被動吸煙方法：將大鼠放入自制的有機玻璃染毒箱（40cm×45cm×50cm）內(nèi)，香煙點燃后，用60mL 注射器吸滿煙霧，然后通過三通管將香煙煙霧快速注入染毒箱內(nèi)（操作頻率為20次／min），進行大鼠被動吸煙染毒。為減少香煙燃燒產(chǎn)生的水蒸氣對大鼠的影響，在箱底放置適量硅膠干燥劑。繼續(xù)飼養(yǎng)90d，第91 天起，在模型組基礎上，NAC低、中、高劑量組分別按26.32、52.64、105.28 mg／kg NAC灌胃（ig），連續(xù)2周。劑量計算參考文獻［5］藥動學研究中給藥劑量標準進行折算，按單體折成平均臨床等效劑量約52.64mg／kg。高劑量約為2倍于平均臨床等效劑量（105.28mg／kg），中劑量為等量平均臨床等效劑量（52.64 mg／kg），低劑量為1／2平均臨床等效劑量（26.32mg／kg）。對照組、模型組大鼠每天給予2mL 生理鹽水ig，相同室內(nèi)環(huán)境下自由飲食飲水。

1.2.2 血管活性物質(zhì)檢測 取靜脈血2mL，離心（4℃，1 000r／min，10min），分離血清，置-70℃凍存。采用硝酸還原酶法測定血清NO，采用比色法測定血清ROS，黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD；硫代巴比妥酸法測定MDA；取靜脈血2 mL，加入30μL的100g／L EDTA Na2和40μL 抑肽酶，離心（4℃，4 000r／min，10 min）分離血漿，置-70℃凍存。采用放免法測定血漿ET；取靜脈血5mL，加入冰浴的酶抑制劑30μL和0.3mmol EDTA Na2，離心（4℃，1 000r／min，5min），分離血漿，置-70℃凍存，采用放免法在冰浴中測定AngⅡ。均嚴格按說明書操作進行檢測。

1.2.3 NF-κB 活性表達檢測 取肺組織采用免疫組化SABC法測定，按試劑盒說明書進行操作，NF-κB 活性表達以NF-κB陽性細胞率表示，高倍光鏡下隨機觀察10個視野，至少計數(shù)1 000個細胞，取其陽性細胞數(shù)平均值為該組的細胞陽性率。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 13.0軟件。計量資料用均數(shù)±標準差（±SD）表示。組間比較用單因素方差分析及t檢驗。采用Spearman方法分析相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血管活性物質(zhì)水平

與對照組比較，模型組AngⅡ、ROS、ET、MDA水平均極顯著升高（P＜0.01），而NO、SOD 水平均極顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，低劑量組NO 水平升高、ET 水平顯著下降（均P＜0.05）；中劑量組AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平顯著下降或極顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），而NO、SOD 水平均顯著升高（均P＜0.05）；高劑量組AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平均極顯著下降（P＜0.01）而NO、SOD 水平均極顯著升高（均P＜0.01）（表1）。

表1 各組血管活性物質(zhì)水平比較Table 1 Comparison of the levels of vasoactive substances in each group

2.2 NF-κB活性表達檢測

與對照組比較，模型組NF-κB陽性細胞率極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組NF-κB陽性細胞率下降，但差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），中劑量組NF-κB 陽性細胞率顯著下降（P＜0.05），高劑量組NF-κB 陽性細胞率極顯著下降（P＜0.01）（圖1）。

圖1 各組NF-κB活性表達比較Fig.1 Comparison of NF-κB activities in each group

2.3 相關(guān)性分析

AngⅡ 水平與NF-κB 活性，AngⅡ 水平與ROS水平均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，r值分別為0.835和0.864（P＜0.01）。

3 討論

COPD 發(fā)病機制的研究集中于氣道炎癥及感染、蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)失衡、黏液分泌過多和小氣道阻塞方面［6］，但近來的研究顯示氧化應激損傷在COPD 發(fā)病機制中有重要影響［7］，各種類型的氧化劑通過損害血清蛋白酶抑制劑，加強彈性酶的活性和增加黏液的分泌參與COPD 的病理過程［8］，氧化劑還通過直接氧化，作用于花生四烯酸而產(chǎn)生異前列腺素，其對氣道產(chǎn)生多種效應，包括支氣管縮窄、血漿漏出增加和黏液過度分泌［9］。此外，氧化劑能活化轉(zhuǎn)錄NF-κB，NF-κB可協(xié)助轉(zhuǎn)錄其他許多炎癥因子而加重COPD 病理改變［10］。

NF-κB 的活化過程可被抗氧化劑等抑制，抗氧化劑能對抗氧自由基的損傷，抑制ROS介導的激活NF-κB 的過程，此類抗氧化劑的代表如NAC。NAC是一種含-SH 的小分子化合物，易于進入細胞并在細飽內(nèi)去乙酸化后生成L-半胱氨酸，提供合成細胞內(nèi)重要的非酶類抗氧化物還原型谷胱甘肽（GSH）的底物，補充細胞內(nèi)GSH 的含量，對抗ROS等氧化損傷。

由于氧化應激反應引起機體AngⅡ分泌水平升高，誘導ROS等的產(chǎn)生［11］，大量的ROS氧自由基使舒血管物質(zhì)NO 失活，縮血管物質(zhì)ET 大量產(chǎn)生，使對血管舒縮功能具有調(diào)節(jié)作用的NO／ET失衡，同時，由于炎癥因子的損害作用，SOD 活性降低而MDA 活性表達上升［12］。氧化應激造成血管損傷、血漿漏出增加、加重炎癥及感染，這些因素加重COPD 癥狀，使臨床治療COPD 耗時低效。在本試驗中，觀察到與對照組比較，模型組AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平均顯著升高，表明氧化應激損傷引起COPD 病理變化，同時，模型組NF-κB 陽性細胞率顯著升高，與對照組比較差異也有統(tǒng)計學意義，表明COPD 炎癥加重，此外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示AngⅡ水平與NF-κB 活性以及AngⅡ水平與ROS水平均呈顯著正相關(guān)，提示降低AngⅡ水平，從而減少ROS的產(chǎn)生，進而抑制NF-κB 活化過程是改善COPD 氧化損傷的一條途徑。

采用NAC 干預后，觀察到與模型組比較，低劑量組NO 水平顯著升高、ET 水平顯著下降；中劑量組AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平顯著下降或極顯著下降而NO、SOD 水平均顯著升高；高劑量組AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平均顯著下降而NO、SOD 水平均極顯著升高，說明NAC 能改善COPD 氧化損傷，但與劑量有關(guān)，低劑量效果不明顯，以高劑量改善效果明顯，提示臨床上治療COPD 可能需要較大的劑量。綜合本試驗結(jié)果，推測NAC 可能通過調(diào)節(jié)AngⅡ水平，抑制ROS 以及NF-κB 活化，提高SOD 等水平發(fā)揮抗氧化應激損傷作用的，也為新型抗氧化劑的開發(fā)提供了思路。

［1］劉紹霞，楊嵐，齊詠，等.N-乙酰半胱氨酸治療對慢性阻塞性肺疾病患者呼吸功能的影響［J］.臨床醫(yī)學，2003，23（6）：9，58

［2］王月花.N-乙酰半胱氨酸治療對慢性阻塞性肺疾病患者肺功能的影響［J］.臨床醫(yī)藥實踐雜志，2004，13（9）：686-687.

［3］宋一平，崔德健，茅培英.慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及藥物干預的影響［J］.軍醫(yī)進修學院學報，2001，22（2）：99-102.

［4］金 焱，龐寶森，武維屏，等.一種實驗性大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的建立［J］.心肺血管病雜志，2004，23（3）：179-181.

［5］黃娟萍，羅 裕，江 力，等.中藥藥動學研究中給藥劑量的現(xiàn)狀分析［J］.中國藥學雜志，2012，47（21）：1685-1689.

［6］Karakiulakis G，Roth M.Muscarinic receptors and their antagonists in COPD：anti-inflammatory and antiremodelingeffects［J］.Mediator Inflamm，2012，2012：409580.

［7］Gouzi F，Abdellaoui A，Molinari N，et al.Fiber atrophy，oxidative stress and oxidative fiber reduction are the attributes of different phenotypes in chronic obstructive pulmonary disease patients［J］.J Appl Physiol，2013，115（12）：1796-1805

［8］Wozniak A，Górecki D，Szpinda M，et al.Oxidant-antioxidant balance in the blood of patients with chronic obstructive pulmonary disease after smoking cessation［J］.Oxid Med Cell Longev，2013，897075，doi：10.1155／2013／897075

［9］Stanojkovic I，Kotur-Stevuljevic J，Spasic S，et al.Relationship between bone resorption，oxidative stress and inflammation in severe COPD exacerbation［J］.Clin Biochem，2013，20（13）：00359-7.

［10］Greiner J F，Müller J，Zeuner M T，et al.1，8-Cineol inhibits nuclear translocation of NF-κB p65 and NF-κB-dependent transcriptional activity［J］.Biochim Biophys Acta ，2013，1833（12）：2866-2878.

［11］Quinn M T，Gauss K A.Structure and regulation of the neutrophil respiratory burst oxidase：comparison with nonphagocyte oxidases［J］.J Leukoc Biol，2004，76（4）：760-781.

［12］Wolin M S，Ahmad M，Gupte S A.Oxidant and redox signaling in vascular oxygen sensing mechanisms：basic concepts，current controversies，and potential importance of cytosolic NADPH［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，289（2）：L159-L173.