王白楊，肖新光，唐世華，劉 岑

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室，廣西南寧530007）

明膠/Fe2S3納米生物復(fù)合物形成反應(yīng)的熱力學(xué)及明膠構(gòu)象變化

王白楊，肖新光，唐世華*，劉 岑

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室，廣西南寧530007）

在p H=7.40條件下，采用一鍋化學(xué)反應(yīng)法制得水溶性明膠/Fe2S3納米生物復(fù)合物，掃描電鏡照片顯示Fe2S3顆粒為棒狀。根據(jù)吸光度與Fe2S3濃度關(guān)系，由Benesi-Hildebrand方程計算了不同溫度下反應(yīng)的形成常數(shù)K（293 K：14.47×102L.molˉ1；297 K：9.24×102L.molˉ1；309 K：1.70×102L.molˉ1）及對應(yīng)溫度下反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)（ΔrGm=ˉ17.88/ˉ16.68/ˉ13.09 kJ.molˉ1；ΔrHm=ˉ105.57 kJ.molˉ1；ΔrSm=ˉ299.28 J.Kˉ1.molˉ1），結(jié)果表明明膠/ Fe2S3納米生物復(fù)合物的形成反應(yīng)是自發(fā)的放熱過程，且為焓驅(qū)動。傅里葉變換紅外光譜表明，F(xiàn)e2S3主要與明膠大分子肽鏈中的酰胺鍵結(jié)合；對紅外光譜進(jìn)行去卷積擬合，結(jié)果表明：明膠蛋白質(zhì)的α-螺旋含量減少，β-折疊含量明顯增加。結(jié)合紫外和紅外光譜測試結(jié)果對復(fù)合物的形成機理作了初步的推測：首先Fe3+與明膠大分子中的酰胺鍵結(jié)合形成明膠/Fe3+復(fù)合物，然后S2ˉ與明膠/Fe3+中的Fe3+形成明膠/Fe2S3復(fù)合物。

明膠/Fe2S3納米生物復(fù)合物；明膠；熱力學(xué)參數(shù)；構(gòu)象變化

納米生物復(fù)合物是指由納米尺寸的無機組分和生物大分子結(jié)合在一起形成的新一代的納米結(jié)構(gòu)生物雜化材料[1]。納米生物復(fù)合材料兼具了生物大分子選擇催化、識別的特性和納米材料電子、光電子和催化性能，是一種新型的生態(tài)材料，已成為快速發(fā)展的新研究領(lǐng)域[2]。明膠是膠原經(jīng)過酸式或堿式水解得到的熱變性的纖維狀蛋白質(zhì)分子，廣泛存在于動物的骨和皮中，是最早商品化的蛋白質(zhì)[3]。明膠無毒，容易成膜，具有極好的溶脹和吸水性能、生物相容性以及生物降解性[4]。作為一種天然生物大分子，明膠廣泛應(yīng)用于食品加工、電化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、制藥以及組織工程等領(lǐng)域[5，6]。明膠分子中含有許多官能團(tuán)（雙鍵、-NH2、-SH和-COOH）[7]，是制備納米生物復(fù)合材料理想的生物模板，近年來在納米材料制備方面的應(yīng)用受到越來越多的科研工作者的青睞。以明膠為包覆劑和穩(wěn)定劑制備無機納米材料的方法被稱為是簡單的和“綠色”的方法[8]。

金屬硫化物具有優(yōu)異的電學(xué)、光學(xué)和磁學(xué)特性，因此可以應(yīng)用于光電轉(zhuǎn)換、光催化、光發(fā)射二極管、太陽能電池、生物熒光探針等領(lǐng)域[9，10]。金屬硫化物體系中，硫化鐵是一個非常復(fù)雜的體系，當(dāng)Fe和S的化學(xué)計量比以及硫化鐵納米材料晶體結(jié)構(gòu)不同時，這些材料會表現(xiàn)出獨特的電學(xué)和磁學(xué)性質(zhì)[11]，這些性質(zhì)決定了硫化鐵納米材料將被廣泛應(yīng)用于高能量密度電池和太陽能光電材料。

明膠與Fe3+的相互作用已見諸文獻(xiàn)[12，13]。以明膠水溶液為介質(zhì)，用金屬鹽溶液與含硫化合物（Na2S、硫代乙酰胺和H2S等）合成納米金屬硫化物亦有文獻(xiàn)報道（CuS、ZnS[14]、Ag2S[15]、HgS[16]、PbS[17]、CdS[18]），但迄今為止，所有有關(guān)明膠/無機納米材料的研究都集中在材料的制備、表征和新穎功能的開發(fā)方面[19]，明膠基納米復(fù)合材料形成反應(yīng)的熱力學(xué)特征和反應(yīng)過程中明膠構(gòu)象變化等則鮮見報道。

鑒于此，本文在p H=7.40條件下采用一鍋化學(xué)反應(yīng)法合成了明膠/Fe2S3納米生物復(fù)合物溶液;利用紫外-可見光譜研究了鍵合反應(yīng)的熱力學(xué)特征;利用紅外光譜研究了結(jié)合位點和明膠蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化;初步推測了反應(yīng)機理;結(jié)合掃描電鏡技術(shù)，研究了Fe2S3顆粒形貌。研究結(jié)果不僅為該類納米材料的制備和安全應(yīng)用提供了理論依據(jù)，也為建立納米材料安全評價體系積累了必要的實驗數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

明膠（CP，Type B，上海化學(xué)試劑分裝廠，SDS凝膠電泳法測得分子量約為100 kDa）;FeCl3.6H2O（AR，汕頭市光華化學(xué)廠）;Na2S.9H2O（AR，成都市科龍化工試劑廠）;鹽酸和NaOH（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;實驗用水為二次蒸餾水。

2802 PCS型紫外-可見吸收光譜儀（尤尼柯，上海）;AS-21P型恒溫自動控制器（尤尼柯，上海）;500Ⅱ型傅立葉紅外分光光度計（美國Nicolet）;PHS-3D功能型p H計（上海三信儀表廠）;S-4800型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi）。

1.2 實驗方法

準(zhǔn)確量取濃度為1.25×10ˉ4mol.Lˉ1的明膠溶液1.00×10ˉ2L，分別置于2.50×10ˉ2L的燒杯中，加入不同體積的濃度為1.00×10ˉ3mol.Lˉ1的Fe3+離子溶液，攪拌均勻，在酸度計檢測下，用HCl和NaOH稀溶液調(diào)節(jié)溶液p H值為7.40;再在各個燒杯中加入濃度為0.10 mol.Lˉ1的S2ˉ離子溶液5.00×10ˉ4L，攪拌均勻，調(diào)節(jié)溶液p H為7.40;將溶液轉(zhuǎn)移到2.50×10ˉ2L的比色管中，用p H為7.40的水定容至刻度。即得到明膠和S2ˉ濃度不變、Fe3+濃度不同的系列溶液。將樣品溶液保持在測試溫度下的恒溫水浴中平衡10 h，以備后續(xù)的紫外測試。

用2802 PCS紫外-可見吸收光譜儀測定體系的紫外-可見吸收光譜，掃描范圍190～800 nm。將樣品濃縮得固體樣品，測定其紅外光譜。用掃描電子顯微鏡觀察納米顆粒的形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 明膠/Fe2S3的掃描電鏡照片

圖1為樣品溶液的掃描電鏡照片。由圖可知：在p H=7.40的明膠溶液中形成的Fe2S3顆粒為棒狀，顆粒的平均粒徑為139 nm，平均長度為1160 nm。實驗條件下所制備的明膠/Fe2S3溶液室溫放置5天，無沉淀生成，這與水溶性的明膠大分子對納米顆粒表面進(jìn)行了化學(xué)修飾有關(guān)。按實驗方法制備水溶性納米材料，方法簡便，可操作性強。

圖1 明膠/Fe2S3溶液的SEM照片SEM image of gelatin/Fe2S3[gelatin]=5.00×10ˉ5mol.Lˉ1，[Fe3+]=1.00×10ˉ4mol.Lˉ1and[S2ˉ]=2.00×10ˉ3mol.Lˉ1

2.2 明膠、明膠/Fe3+和明膠/Fe2S3的紅外光譜

實驗測得明膠蛋白質(zhì)的紅外特征峰位置分別為：2926.49 cmˉ1（酰胺B帶：CH2-的反對稱伸縮振動），1631.33 cmˉ1（酰胺Ⅰ帶：C O或反對稱羧基伸縮振動），1543.71 cmˉ1（酰胺Ⅱ帶：CN伸縮或N-H彎曲振動）和1245.60 cmˉ1（酰胺Ⅲ帶：主要是C-N伸縮振動）[20-23]。加入Fe3+后C O伸縮振動頻率降低至1625.44 cmˉ1，而C-N和N-H混頻（主要是N-H彎曲振動）的振動頻率升高至1555.26 cmˉ1，表明Fe3+與明膠大分子的酰胺鍵結(jié)合，碳和氧原子間的電子云密度向氧原子方向移動，從而導(dǎo)致羰基的振動頻率減小，C-N和N-H混頻的振動頻率升高[24]?？紤]到Fe3+電荷/離子半徑比高，球形對稱，主要與以氧為配位原子的基團(tuán)形成穩(wěn)定配合物[25]，故可推測，F(xiàn)e3+主要與酰胺鍵的氧結(jié)合形成明膠/ Fe3+復(fù)合物，但不能排除其與氮結(jié)合的可能。441.45 cmˉ1處出現(xiàn)新峰，進(jìn)一步證明復(fù)合物的形成。與明膠/Fe3+相比，加入Na2S后，C=O伸縮振動頻率升高至1631.40 cmˉ1，而C-N和NH混頻的振動頻率變化不大（1554.96 cmˉ1），并在438.05 cmˉ1處出現(xiàn)新峰，與黃鐵礦的伸縮振動特征峰411.97 cmˉ1位置接近[26]，說明生成了明膠/Fe2S3復(fù)合物。另外，明膠/Fe3+和明膠/Fe2S3的生成對明膠大分子的構(gòu)象產(chǎn)生了微擾（明膠的CH2-反對稱伸縮振動由2926.49 cmˉ1變化為2928.02 cmˉ1和2926.53 cmˉ1，彎曲振動由1446.44 cmˉ1變化為1443.01 cmˉ1和1445.76 cmˉ1）。

2.3 明膠、明膠/Fe3+、明膠/Fe2S3和Fe2S3溶液的紫外-可見吸收光譜

圖2是以p H=7.40的水為參比，測得的明膠、明膠/Fe3+、明膠/Fe2S3和Fe2S3溶液的紫外-可見吸收光譜。由圖可看出，明膠在230 nm附近有一強吸收峰，280 nm附近有一較強的吸收肩峰，在320～800 nm范圍內(nèi)無吸收。230 nm附近的吸收主要是由明膠肽鍵C O基的π-π*躍遷所引起的，與明膠的α-螺旋含量有關(guān); 280 nm附近的吸收是由芳香氨基酸殘基π-π*躍遷產(chǎn)生的[27]。與明膠的紫外-可見吸收光譜相比，明膠/Fe3+的紫外-可見吸收光譜在230和280 nm的位置吸光度都有所增強，表明Fe3+與明膠結(jié)合，導(dǎo)致明膠蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，疏水腔中的色氨酸（Trp）和酪氨酸（Try）等芳香氨基酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生改變，逐漸暴露，Trp吲哚環(huán)上的氮和Try酚基上的氧親水性增強，與帶正電荷的Fe3+作用，使芳香氨基酸殘基π-π*躍遷能級降低，發(fā)生增色現(xiàn)象[28]。明膠/Fe2S3的紫外-可見吸收光譜在230和280 nm的位置吸光度也有所增加，且230 nm附近峰形變寬，說明S2ˉ與原先配位狀態(tài)的Fe3+形成了Fe2S3微粒，對明膠蛋白質(zhì)的作用更為明顯，使明膠肽鏈伸展程度更大，包圍在明膠高分子鏈內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團(tuán)裸露出來的更多，表現(xiàn)為230 nm和280 nm的位置吸光度增加更為顯著。插圖為Fe2S3和明膠/Fe2S3體系吸收峰的局部放大圖，可以明顯的看出Fe2S3溶液的吸收峰位于394 nm和615 nm處，而明膠/Fe2S3溶液的吸收峰位于430 nm和630 nm處，這說明S2ˉ與結(jié)合在明膠分子上的Fe3+鍵合生成了Fe2S3微粒。

圖2 明膠（1）、明膠/Fe3+（2）、Fe2S3（3）和明膠/Fe2S3（4）的紫外-可見吸收光譜The UV-Vis absorption spectra of gelatin（1），gelatin/Fe3+（2），F(xiàn)e2S3（3）and gelatin/Fe2S3（4）[gelatin]=5.00×10ˉ5mol.Lˉ1，[Fe3+]=1.00×10ˉ4mol.Lˉ1and[S2ˉ]=2.00×10ˉ3mol.Lˉ1

2.4 紅外光譜去卷積法研究明膠蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化

納米微粒與蛋白質(zhì)的結(jié)合往往伴隨著蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的明顯改變，這方面的研究對于探討納米顆粒生物學(xué)效應(yīng)的本質(zhì)尤為重要。酰胺Ⅰ帶（1600～1700 cmˉ1）經(jīng)常被用于研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[29]，為了進(jìn)一步分析明膠二級結(jié)構(gòu)的變化情況，利用去卷積方法對酰胺Ⅰ帶進(jìn)行擬合并結(jié)合文獻(xiàn)中對明膠中各子峰的歸屬（1646～1661 cmˉ1為α-螺旋結(jié)構(gòu)，1610～1637 cmˉ1和1682～1698 cmˉ1為β-折疊結(jié)構(gòu)，1661～1681 cmˉ1為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1637～1645 cmˉ1為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[30，31]）得圖3和表1。

由圖3和表1可知，純明膠中包含四種結(jié)構(gòu)：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。與純明膠相比，明膠/Fe3+和明膠/Fe2S3復(fù)合物中明膠二級結(jié)構(gòu)的α-螺旋和無規(guī)卷曲含量均減少，β-折疊含量明顯增加。α-螺旋含量減少說明Fe3+和形成的Fe2S3微粒與明膠大分子肽鏈結(jié)合，削弱或破壞了氫鍵[32]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)骨架松散和伸展，明膠微環(huán)境的疏水性減弱以及明膠二級結(jié)構(gòu)改變（二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變），這與紫外光譜的分析結(jié)果是一致的。

圖3 明膠（A）、明膠/Fe3+（B）和明膠/Fe2S3（C）酰胺Ⅰ帶的紅外去卷積擬合圖The deconvolution curve-fitting figures of amideⅠband of gelatin（A），gelatin/Fe3+（B）and gelatin/Fe2S3（C）from FT-IR spectra

2.5 明膠/Fe2S3納米生物復(fù)合物的形成機理推測

綜合紫外光譜、紅外光譜以及紅外光譜去卷積擬合的分析結(jié)果可推測，明膠/Fe2S3復(fù)合物的形成可能包括兩個階段[33]：首先Fe3+和明膠大分子肽鏈中酰胺鍵發(fā)生作用形成明膠/Fe3+復(fù)合物，這個過程中明膠是結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑和氧的來源。隨著Na2S的加入，S2ˉ與已經(jīng)結(jié)合在明膠分子上的Fe3+作用生成Fe2S3微粒，這一步中明膠作為包覆劑對降低成核作用的活化能起著重要的作用。類似現(xiàn)象在HgS納米晶體的仿生合成[32]、CdS/BSA納米復(fù)合物的合成[34]、PbS納米立方體的仿生合成[35]以及明膠溶液中笤帚狀納米CdS的合成中都有報道[24]。該機理可用以下示意圖表示（以羰基的結(jié)合為例）。

表1 明膠、明膠/Fe3+和明膠/Fe2S3紅外光譜子峰的歸屬及面積百分含量Secondary structure analyses（infrared spectra）from the gelatin，gelatin/Fe3+and gelatin/Fe2S3

式1 明膠/Fe2S3納米生物復(fù)合物的形成機理Schematic representation of the formation of gelatin/Fe2S3bionanocomposites

2.6 明膠和Fe2S3鍵合反應(yīng)的形成常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)

圖4為以純明膠溶液為參比，不同濃度明膠/ Fe2S3溶液的紫外-可見吸收光譜，其中1#為參比。由圖4可看出，明膠/Fe2S3體系在430 nm處有強吸收峰，在622 nm處有一肩峰。以430 nm處復(fù)合物的吸光度對Fe2S3濃度作圖（見圖中插圖），良好的直線關(guān)系說明體系在此處的吸光度與Fe2S3濃度之間符合Beer-Lambert定律。其它溫度下亦有直線關(guān)系（297 K，R=0.9961;309 K，R=0.9988）。

圖4 明膠/Fe2S3體系的紫外-可見吸收光譜（293 K）UV-Vis spectra of gelatin/Fe2S3system（293 K）[gelatin]=5.00×10ˉ5mol.Lˉ1;[Fe2S3]/（10ˉ4mol.Lˉ1）correspondingto 1 13：0.00，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90，1.00，1.20，1.50，1.80

明膠/Fe2S3復(fù)合物的形成反應(yīng)可由式（1）給出，其中K為表觀形成常數(shù)：

Benesi-Hildebrand方程（式（2））[37]已被用于研究一些無機納米顆粒如Ag[38]、CdS[39]、ZnO[40]、Ag TiO2[41]等與牛血清白蛋白的結(jié)合反應(yīng)。

以（AˉA0）ˉ1對[Fe2S3]ˉ1作圖見圖5。式中A為不同F(xiàn)e2S3濃度下明膠/Fe2S3溶液的吸光度; A0為純明膠的吸光度;Amax為最大Fe2S3濃度下明膠/Fe2S3溶液的吸光度;[Fe2S3]為Fe2S3濃度。由直線的斜率和截距求得各溫度下反應(yīng)的表觀形成常數(shù)K列于表2。

表觀形成常數(shù)K，可看作為明膠/Fe2S3復(fù)合物生成反應(yīng)的平衡結(jié)果[41]，因而可引入Van＇t Hoff公式（3），用以得到過程中的焓變（ΔrHm）與熵變（ΔrSm）;當(dāng)溫度變化不大時，反應(yīng)的焓變ΔrHm可看成一個常數(shù)，由式（3），以ln K對1/T進(jìn)行線性擬合，得直線方程為：ln K=ˉ35.997+ 12698.009/T，R=0.9996;根據(jù)擬合結(jié)果求得ΔrHm和ΔrSm，進(jìn)而由式（4）計算出反應(yīng)的Gibbs自由能變ΔrGm亦列于表2。

式中，R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度，K為對應(yīng)溫度下的形成常數(shù)，ΔrHm為焓變，ΔrSm為熵變。

圖5 不同溫度下的（AˉA0）ˉ1對[Fe2S3]ˉ1作圖The plots of（AˉA0）ˉ1υs[Fe2S3]ˉ1at different temperatures

表2 明膠和Fe2S3鍵合反應(yīng)的形成常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Formation constants and thermodynamic parameters of the gelatin and Fe2S3binding reaction

表2數(shù)據(jù)顯示，反應(yīng)的ΔrGm和ΔrHm均為負(fù)值，說明該反應(yīng)是自發(fā)和放熱的，且為焓驅(qū)動。ΔrSm為負(fù)值的原因可解釋為：大量的S2ˉ、Fe3+和明膠鍵合生成明膠/Fe2S3復(fù)合物，體系中總的分子數(shù)目減少[42];明膠蛋白質(zhì)采取特定的構(gòu)象以有利于Fe2S3的成核，以及包覆在顆粒表面以增強其在水中的穩(wěn)定性，從而損失了可觀的構(gòu)象熵[43，44]。另外，ΔrHm小于零，表明Fe3+與明膠、S2ˉ與明膠/ Fe3+之間靜電作用力較強，這有利于反應(yīng)的進(jìn)行[29]。

3 結(jié)論

采用一鍋化學(xué)反應(yīng)法制得水溶性的明膠/ Fe2S3納米生物復(fù)合物，復(fù)合物穩(wěn)定性較好;紅外光譜表明形成的復(fù)合物中Fe2S3主要與明膠肽鏈中酰胺鍵發(fā)生作用;紅外光譜去卷積結(jié)果表明，F(xiàn)e2S3與明膠的結(jié)合改變了明膠的二級結(jié)構(gòu);明膠/Fe2S3納米生物復(fù)合物的形成機理可描述為：Fe3+和明膠大分子肽鏈中酰胺鍵發(fā)生作用形成明膠/Fe3+絡(luò)合物，S2ˉ與已經(jīng)結(jié)合在明膠分子上的Fe3+反應(yīng)生成Fe2S3微粒即明膠/Fe2S3納米生物復(fù)合物;計算反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明：該反應(yīng)是自發(fā)的放熱過程，且為焓驅(qū)動。

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The Thermodynamics of Gelatin/Fe2S3Bionanocomposites Formation and Gelatin Conformational Change

WANG Baiyang，XIAO Xinguang，TANG Shihua*，LIU Cen
（Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products，School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi Uniυersity for Nationalities，Nanning 530007，Guangxi，P.R.China）

The gelatin/Fe2S3bionanocomposite was synthesized via a facile one-pot chemical route at p H=7.40. The SEM image showed that the shapes of the bionanocomposites were rod-like.Based on the relationship between the absorbance data of system and the concentration of Fe2S3，the Benesi Hildebrand equation was used to calculate the formation constants K（293 K：14.47 102L.molˉ1;297 K：9.24 102L.molˉ1;309 K：1.70 102L.molˉ1）at three different temperatures.Thermodynamic parameters were also determined（ΔrGm= ˉ17.88/ˉ16.68/ˉ13.09 kJ.molˉ1;ΔrHm=ˉ105.57 kJ.molˉ1;ΔrSm=ˉ299.28 J.Kˉ1.molˉ1）.The results indicated the formation process was spontaneous，exothermic and enthalpy-driven.FT-IR data indicated that the amide linkage in gelatin polypeptide chain can be especially active sites for the nucleation and growth of Fe2S3.The effect of Fe3+and Fe2S3on the conformations of gelatin macromolecule had also been analyzed by means of UV-vis and FT-IR spectra.The results showed that there was lessα-helix content and moreβ-sheet structures due to integration of them.By integrating the information of the UV-vis and FT-IR analyses of the synthesized samples，a most plausible formation mechanism of the gelatin/Fe2S3bionanocomposites was given：Fe3+coordinated with amide linkage in gelatin macromolecule to form gelatin/Fe3+complex，then S2ˉcombined with Fe3+cooperated by gelatin to form gelatin/Fe2S3.

gelatin/Fe2S3bionanocomposite;gelatin;thermodynamic parameter;conformation change

10.7517/j.issn.1674-0475.2014.06.505

1674-0475（2014）06-0505-09

2014-03-02收稿，2014-06-09錄用

國家自然科學(xué)基金（21067001）和廣西民族大學(xué)研究生教育創(chuàng)新計劃（gxun-chx2012091）資助

*通訊作者，E-mail：shtang5@163.com

*Corresponding author，E-mail：shtang5@163.com