王曼麗，李鑫，張肖會，明華蜜，尹洪宗*，徐坤

（1.山東農業(yè)大學化學與材料科學學院，山東泰安271000; 2.山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院，山東泰安271000）

鏑熒光探針的構建及對牛奶中四環(huán)素殘留的檢測

王曼麗1，李鑫1，張肖會1，明華蜜1，尹洪宗1*，徐坤2*

（1.山東農業(yè)大學化學與材料科學學院，山東泰安271000; 2.山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院，山東泰安271000）

在乙醇體系中構建三元配合物的鏑熒光探針，并利用鹽酸四環(huán)素（TC）對鏑熒光探針具有熒光猝滅作用，提出了一種檢測牛奶中四環(huán)素殘留的新方法。首先確定體系的激發(fā)波長為305 nm，發(fā)射波長為574 nm。在配比、加料順序、時間等方面對鏑熒光探針進行了條件優(yōu)化，確定了鏑離子（Dy3+）、磺基水楊酸（SSA）、三正辛基氧化磷（TOPO）的最佳配比為1∶2∶0.1和30 min最佳檢測時間。其次建立了檢測鹽酸四環(huán)素的線性曲線，并獲得檢測范圍為10ˉ6～2× 10ˉ5mol/L。最后，利用此熒光探針對處理的牛奶樣品進行加樣回收檢測，回收率在96.9%～104.4%。實驗證明建立的方法科學可行，對鹽酸四環(huán)素具有高選擇性。

鏑；熒光探針；鹽酸四環(huán)素（TC）；牛奶

四環(huán)素族抗生素因對肺炎球菌、流感菌、革蘭氏細菌、破傷風桿菌、布氏桿菌等多種菌類都有廣譜抗菌作用而被廣泛的應用于畜牧業(yè)。其中鹽酸四環(huán)素是四環(huán)素族中最常用的抗生素。近年來因其濫用而導致肉類和奶類食品中抗生素殘留，并且造成了食品安全問題。經研究發(fā)現四環(huán)素能引起肝臟毒性、非酒精性脂肪炎[1-3]。為此，美國FDA規(guī)定四環(huán)素在牛奶中的殘留限量小于80 μg/L[4];國際衛(wèi)生組織和歐盟規(guī)定在牛奶中的最大殘留限量為100μg/L[5]。盡管殘留量的水平通常很低，但這種長期低水平的接觸方式也容易產生各種慢性毒性，對人類健康和環(huán)境造成危害。因此，建立相應的監(jiān)控手段和檢測方法來控制四環(huán)素族抗生素在動物性食品中的殘留是非常必要的。目前檢測鹽酸四環(huán)素的常用方法有：高效液相色譜法（HPLC）[6-8]、熒光法[9]、傳感器法[10]、酶聯免疫法（ELISA）、表面等離子體共振法[11]、層析法等一系列方法。雖然這些方法能夠精確測量大多樣品中抗生素的含量，但存在費力、費時、費錢，儀器設備昂貴，靈敏性差，樣品檢測需大型分析儀器和在實驗室內進行，以及需要專業(yè)人員進行操作等缺陷。因此，尋求快速、簡便、靈敏度高的鹽酸四環(huán)素檢測方法，以保障人們飲用牛奶的衛(wèi)生和安全是非常必要的。

熒光探針技術自興起就被廣泛研究[12]。其中稀土鏑離子因f電子極少參加化學成鍵，配位點很豐富，而受到研究者的關注[13]。其熒光光譜基本上保持水合Dy（Ⅲ）的熒光峰波長，熒光強度隨配位體的不同而變化，而Dy（Ⅲ）絡合物作為擴散控制非輻射能量轉移的給予體，只要求研究體系在470～650 nm波長范圍內有明顯吸收峰就行，這使Dy（Ⅲ）熒光探針的應用范圍廣泛[14]，因此本文構建Dy3+-SSA-TOPO熒光探針檢測鹽酸四環(huán)素。該方法靈敏度高、選擇性好、干擾較少、操作簡單、加樣回收率高等優(yōu)點。本文成功地將鏑熒光探針應用于四環(huán)素抗生素的檢測，為食品中的四環(huán)素族抗生素的殘留檢測提供了新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：RF-5301PC型熒光分光光度計（日本島津公司）;PHS-3D p H計（上海精密科學儀器有限公司）;BS210S型電子天平（德國賽多利斯公司）; TGL-20M高速臺式冷凍離心機（湘儀離心機）; HJ-3數碼恒溫磁力攪拌器（常州國華電器有限公司）;KQ-200KDE型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

試劑：氧化鏑（Dy2O3，上海晶純試劑有限公司，AR），磺基水楊酸（SSA，天津市博迪化工有限公司，AR），三氯乙酸（CCl3.COOH，上海山浦化工有限公司，AR），濃鹽酸（HCl，煙臺市雙雙化工有限公司）。鹽酸四環(huán)素、土霉素、金霉素、紅霉素購于上海晶純試劑有限公司，USP級;無水乙醇（天津市永大化學試劑有限公司，AR），200mL袋裝純牛奶（購于商場）。實驗中所用水均為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

1.00 ×10ˉ2mol/L DyCl3：準確稱取0.3730 g的氧化鏑于小燒杯中，加入適量濃鹽酸，在通風櫥中用電熱套加熱使其溶解，并加熱使?jié)恹}酸揮發(fā)至近干，然后用無水乙醇定容至100 mL，作為儲備液，使用時用無水乙醇稀釋。SSA，TOPO試劑用無水乙醇配制成濃度為1.00×10ˉ2mol/L的儲備溶液。300 g/L三氯乙酸溶液：準確稱取15.0000 g的三氯乙酸于小燒杯中，用無水乙醇溶解并定容。鹽酸四環(huán)素用無水乙醇配制為1.00×10ˉ3mol/L的溶液，并置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乙醇體系鏑熒光探針的構建

取5支10 m L比色管分別依次加入Dy3+、SSA、TOPO、TC等溶液各1 mL，用無水乙醇定容至刻度線搖勻，放置30 min后，使用熒光分光光度計在波長為200～600 nm范圍內測定溶液的熒光光譜，1 cm的熒光池，狹縫為5 nm。根據上述步驟分別測定Dy3++TOPO、Dy3++TC、Dy3++ SSA、TC+SSA、SSA+TOPO、Dy3++SSA+TC、SSA+TOPO+TC、Dy3++SSA+TOPO+TC，8個溶液體系的熒光強度。

1.2.3 實驗條件的優(yōu)化

首先研究Dy3+與SSA、TOPO的配比對體系熒光強度的影響，獲得最佳配比。其次研究Dy3+與SSA、TOPO、TC等物質加料順序對體系熒光強度的影響，獲得熒光強度最強的加料順序。最后按最佳配比和順序在10 mL的比色管中加Dy3+與SSA、TOPO、TC溶液，乙醇定容后每隔10 min測定體系的熒光強度，得出反應時間對體系熒光強度的影響。

1.2.4 選擇性實驗

構建程序切片所依據的是程序的切片準則，基于程序中的依賴關系來對程序進行切片的。出于對程序執(zhí)行時間的目的考慮，切片準則的設定要保留程序中影響程序執(zhí)行路徑的依賴關系。程序的依賴關系的獲取要對程序的控制流和數據流分析來獲得。構建程序的依賴關系首先要構建程序的數據依賴關系以及程序的控制依賴關系。其中程序的數據依賴關系以及控制依賴關系分別使用程序的控制流程圖和數據依賴圖來描述。

固定Dy3+-SSA-TOPO體系的溶液中依次加入土霉素、金霉素、紅霉素進行干擾試驗。此外研究牛奶中Ca2+、Mg2+、葡萄糖、半乳糖、膽固醇等共存物質對探針測定影響。

1.2.5 牛奶樣品加樣回收

配制一系列梯度濃度的鹽酸四環(huán)素溶液，用Dy3++SSA+TOPO熒光探針在最優(yōu)條件下檢測體系在λem=574 nm的熒光強度變化。

按照參考文獻[15]方法對牛奶樣品進行處理。取5.0 mL牛奶樣品置于15 mL的離心管中，加入1.5 mL的300 g/L的三氯乙酸溶液，攪拌1 min后，用低速離心機（3500 r/min）離心5 min后，將上清液小心轉移出，靜置1 min后，通過0.45 μm的水系醋酸纖維濾膜過濾，收集濾液備用。

牛奶樣品的檢測：用最優(yōu)條件下的Dy3++ SSA+TOPO作為探針對鹽酸四環(huán)素處理過的牛奶樣品進行檢測。在10 mL比色管中，依次加入1 mL 1.0×10ˉ3mol/L的Dy3+儲備液、2.0 mL 1.0×10ˉ3mol/L的SSA溶液、0.1 mL 10ˉ3mol/L的TOPO溶液，一定濃度的鹽酸四環(huán)素溶液、稀釋20倍后的牛奶上清液0.5 mL，搖勻。放置30 min后，在λex=305 nm，λem=574 nm處測定溶液的相對熒光強度。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜

圖1為Dy3+-SSA體系的熒光光譜圖。由圖可知體系的激發(fā)波長為305 nm，發(fā)射波長為574 nm。

圖1 熒光光譜圖Flurescence spectrumDy3+：1.0×10ˉ4mol/L，SSA：1.0×10ˉ4mol/L

以305 nm波長作為激發(fā)波長，分別測定了Dy3+、SSA、TC、Dy3++TC、TC+SSA、TOPO、Dy3++TOPO、SSA+TOPO、SSA+TOPO+TC等體系的乙醇溶液中的熒光光譜圖，在574 nm處均沒有發(fā)射峰。單純Dy3+幾乎沒有峰這主要是由于在乙醇溶液中，游離態(tài)鑭系離子的摩爾吸收系數太小，所以直接激發(fā)Dy3+時，熒光強度很弱，幾乎可以忽略。在體系中存在SSA時，與Dy3+形成配合物后，能夠提高溶液中Dy3+配合物的發(fā)光效率。單純的鹽酸四環(huán)素（TC）在574 nm處并無特征峰出現，將其加入Dy-SSA-TOPO熒光探針所形成的配合物體系中時，可使體系熒光強度減弱（見圖2曲線1）。這是由于鹽酸四環(huán)素對Dy3+-SSA-TOPO熒光探針有熒光猝滅作用，因此可以用Dy3+-SSA-TOPO熒光探針檢測TC。

圖2 不同體系的熒光光譜Flurescence spectrums of different system1.Dy3+-SSA-TOPO-TC;2.Dy3+-SSA;3.Dy3+-SSA-TOPO Dy3+：1.0×10ˉ4mol/L，SSA：2.0×10ˉ4mol/L，TOPO：1.0×10ˉ5mol/L，TC：5.0×10ˉ6mol/L，λex=305 nm

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1 配比影響

圖3 熒光強度與Dy3+、SSA和TOPO不同配比的關系Fluorescence of different ratio of Dy3+，SSA and TOPO1.Dy3+-SSA;2.Dy3+-SSA-TOPO Dy3+：1.0×10ˉ4mol/L，λex/λem=305 nm/574 nm

由圖3可以看出Dy3+-SSA的配比對體系的熒光強度有很大的影響。由曲線1可以看出，存在Dy3+時，固定其濃度，隨著磺基水楊酸含量增加，體系的熒光強度先增大后減小，當達到Dy3+∶SSA=1∶2時，體系的熒光強度值達到最大。SSA用量增大體系的熒光強度下降，可能原因是隨SSA濃度增大，分子間形成氫鍵，或聚集產生相互作用，此作用可能影響SSA與Dy3+配合，進而影響其熒光強度，故本實驗選擇Dy3+-SSA的配比為1∶2為最佳配比。曲線2可得TOPO的濃度對體系的熒光強度有影響。從圖中可以看出，當Dy3+與SSA的濃度一定時，隨著TOPO濃度的增加，體系的熒光強度先增大后減小，當TOPO濃度達到1.0×10ˉ5mol/L時，即Dy3+∶SSA∶TOPO=1∶2∶0.1時，體系的熒光強度值達到最大，故本實驗選擇Dy3+-SSA-TOPO的配比為1∶2∶0.1為最佳配比。

2.2.2 加料順序的影響

由表1可知，不同的加入順序對體系的熒光強度值If影響不大，這是由于最終發(fā)光的體系是由Dy3+與SSA和TOPO形成配合物通過能量變化后發(fā)出的熒光，和加樣的順序無關。所以本實驗過程中，可以不考慮加入順序對體系的影響。

表1 加入順序的影響Effect of the addition order of reagent

2.2.3 反應時間的優(yōu)化

由圖4可以看出，時間對Dy3+-SSA-TOPOTC體系的熒光強度影響不大，本實驗選擇配好溶液30 min后開始測量。

2.3 探針的選擇性

在1.0×10ˉ4mol/L Dy3+，2.0×10ˉ4mol/L SSA，1.0×10ˉ5mol/L TOPO的溶液中依次加入土霉素、氯霉素、紅霉素進行干擾試驗。固定鹽酸四環(huán)素濃度為1×10ˉ6mol/L，實驗發(fā)現當土霉素、金霉素、紅霉素的濃度低于10ˉ6mol/L時，對探針的熒光猝滅作用可以忽略對鹽酸四環(huán)素的干擾。干擾強度依次為：土霉素＞氯霉素＞紅霉素。由此可知，鏑熒光探針在一定的濃度范圍內能將目標分子從與它有相似結構的分子中區(qū)分出來。此外還考察了牛奶中可能共存物質對探針測定影響，發(fā)現加入100倍Ca2+、Mg2+、葡萄糖，50倍的半乳糖、膽固醇不能使探針體系的熒光發(fā)生猝滅，對探針的選擇性沒有干擾。

圖4 反應時間的影響Effect of the reaction timeDy3+：1.0×10ˉ4mol/L，SSA：2.0×10ˉ4mol/L，TOPO：1.0×10ˉ5mol/L，λex/λem=305 nm/574 nm

2.4 牛奶樣品中加樣回收的檢測

2.4.1 標準曲線的繪制

圖5 鹽酸四環(huán)素的濃度與熒光強度的關系圖Fluorescence spectrums of the system with different concentration of hydrochloric acid tetracyclineDy3+：1.0×10ˉ4mol/L，SSA：2.0×10ˉ4mol/L，TOPO：1.0×10ˉ5mol/L，λex/λem=305 nm/574 nm1-8：1×10ˉ6，3×10ˉ6，5×10ˉ6，1×10ˉ5，1.5×10ˉ5，2×10ˉ5，5×10ˉ5，1×10ˉ4mol/L

在最優(yōu)條件下，利用探針Dy3+-SSA-TOPO測定鹽酸四環(huán)素的濃度與熒光強度值的關系，取得滿意結果。從圖5中可以看出，體系的熒光強度隨鹽酸四環(huán)素的濃度增加而減小。當鹽酸四環(huán)素濃度小于10ˉ6mol/L時，Dy3+-SSA-TOPO-TC體系的熒光強度值與Dy3+-SSA-TOPO的熒光強度值極為接近;當鹽酸四環(huán)素的濃度大于5×10ˉ5mol/L時，探針在574 nm處的特征峰消失。

圖6是鏑熒光探針檢測鹽酸四環(huán)素的標定曲線，從曲線可見，Dy3+-SSA-TOPO-TC體系的熒光強度值隨鹽酸四環(huán)素的濃度的增加而減小。在最優(yōu)條件下，用熒光光度計測定Dy3+-SSA-TOPO探針的熒光強度與鹽酸四環(huán)素的濃度之間的關系：在10ˉ6～2.0×10ˉ5mol/L濃度范圍內，熒光強度與鹽酸四環(huán)素濃度呈線性關系。通過線性擬合得出線性關系曲線：Y=ˉ0.1441X+56.412，R2=0.99902。由此可知此線性關系曲線可以作為檢測鹽酸四環(huán)素的標準曲線。

圖6 鹽酸四環(huán)素的標定曲線The standard curve for the testing of tetracycline

2.4.2 鹽酸四環(huán)素的回收檢測

由于牛奶樣品中未檢測出四環(huán)素，因此我們在牛奶樣品中分別加入定量的鹽酸四環(huán)素進行檢測，檢測結果如表2所示，回收率在97.5%～105.2%之間。由表中數據可知回收率較高，能夠定量回收鹽酸四環(huán)素。由此表明能夠通過加樣回收的測量檢測牛奶樣品中鹽酸四環(huán)素的殘留。同時驗證了用鏑熒光探針檢測牛奶中的鹽酸四環(huán)素的方法能有效、靈敏地檢測牛奶中的鹽酸四環(huán)素含量，靈敏度好并且選擇性高。

表2 牛奶樣品的檢測結果The test results of milk samples

3 結論

本文首先選定磺基水楊酸作為配體敏化稀土離子鏑的發(fā)光，TOPO為協配體，研究了磺基水楊酸、TOPO和稀土離子鏑形成的三元配合物體系的熒光光譜特性及實驗條件對熒光強度的影響。在Dy3+濃度為1×10ˉ4mol/L，鏑離子與磺基水楊酸和TOPO的濃度比為1∶2∶0.1的最佳條件下，配合物熒光體系可發(fā)射鏑離子的強特征熒光，其最大的激發(fā)和發(fā)射波長為305 nm和574 nm。在最佳條件下，以磺基水楊酸和TOPO同稀土離子鏑形成的配合物作熒光探針對鹽酸四環(huán)素標準溶液進行檢測。在10ˉ6～2×10ˉ5mol/L濃度范圍內，鹽酸四環(huán)素濃度與熒光強度呈良好的線性關系，鹽酸四環(huán)素的檢測上限為5×10ˉ5mol/L，檢測下限為10ˉ6mol/L。通過加樣回收實驗和干擾實驗可知，以稀土離子鏑為熒光探針，對鹽酸四環(huán)素有較高的回收率。因此以Dy3+-SSA-TOPO形成的絡合物作為稀土離子熒光探針，能夠快速檢測出鹽酸四環(huán)素抗生素，并且具有靈敏度高和選擇性好的優(yōu)點。

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Construction of Dysprosium Fluorescent Probe and Application of Determination on Tetracrycline Hydrochlorid Residues in Milk

WANG Manli1，LI Xin1，ZHANG Xiaohui1，MING Huami1，YIN Hongzong1*，XU Kun2*
（1.College of Chemistry and Material Science，Shandong Agricultural Uniυersity，Taian 271018，Shandong，P.R.China; 2.College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural Uniυersity，Taian 271018，Shandong，P.R.China）

A novel method for the detection of tetracycline was described on the basis of ternary dysprosium fluorescent probe.The tetracycline hydrochloride has flurescence quenching effect for dysprosium fluorescent probe in ethonal system.The excitation wavelength of the system was at 305 nm and the emission wavelength at 574 nm，respectively.The optimized condition were measured：the best ration of dysprosium（Dy3+），sulfosalicylic acid（SSA），Tri-n-octyl phosphine oxide（TOPO）was 1∶2∶0.1，and the best fluorescence detection time was 30 min.Moreover，the calibration curve of detection for tetracycline hydrochloride was established which ranged from 1×10ˉ6to 2×10ˉ5mol/L.The dysprosium fluorescent probe was utilized to conduct the sample recovery test of the treated milk samples，the recovery of the milk sample test was 96.9% 104.4%.As a result，the experimental research demonstrated that the method constructed is scientific and feasible，and has high selectivity to the tetracycline hydrochloride.

dysprosium;fluorescent probe;hydrochloric acid tetracycline;milk

10.7517/j.issn.1674-0475.2014.06.565

1674-0475（2014）06-0565-07

2014-04-25收稿，2014-06-17錄用

國家自然科學基金（31171953）項目資助

*通訊作者，E-mail：hzyin@sdau.edu.cn，xukun@sdau.edu.cn

*Corresponding author，E-mail：hzyin@sdau.edu.cn，xukun@sdau.edu.cn