李金玲，王婷，李嫄淵，吳淑燕，黃瑞

蘇州大學基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院病原生物學系,蘇州 215123

鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium，S.typhimurium)是一種重要的人畜共患病原菌，主要經(jīng)水和食物傳播，可引起食物中毒和胃腸炎等腸道傳染病，其感染發(fā)病率居沙門菌感染首位。2013年11月美國加利福尼亞州福斯特農(nóng)場發(fā)生了“問題雞肉事件”，波及20多個州，近400人在進食被沙門菌感染的雞肉后出現(xiàn)腸炎等癥狀。在我國，沙門菌的感染率也居高不下。已有研究發(fā)現(xiàn)，針對感染發(fā)生的異源自噬在機體抑制細菌存活和繁殖、減輕機體感染等方面具有重要作用[1,2]。鼠傷寒沙門菌侵入細胞后會引起自噬的發(fā)生，細菌被包裹在雙層膜的自噬體中，最終被降解。因此，深入開展自噬機制的研究，對預防和控制細菌感染具有重要意義。

斑馬魚具有體型短小、通體透明、世代間隔時間短和體外發(fā)育等優(yōu)勢，成為研究脊椎動物發(fā)育的優(yōu)良模式生物[3]。近年來，由于其在研究宿主與致病菌相互作用中發(fā)揮了不可替代的作用，越來越受到科學家的青睞。斑馬魚在受精后72 h(hours post-fertilization，hpf)會完成孵化，從“胚胎”過渡到“幼魚”[4]。此時斑馬魚能自由游動、主動覓食，且其自噬相關(guān)基因全部表達[5]，可用于自噬的研究。但有關(guān)病原菌在斑馬魚體內(nèi)引起的異源自噬罕見報道。本研究用鼠傷寒沙門菌感染幼年斑馬魚，探討其對魚體內(nèi)自噬過程的影響，為致病機制的研究提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株及斑馬魚所用菌株為鼠傷寒沙門菌UF110、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記的UF110。野生型斑馬魚AB品系由蘇州大學基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院王晗教授惠贈。

1.1.2試劑及儀器主要試劑包括氨芐西林(ampicillin，AMP)，1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thiourea, PTU)，阿米卡星(amikacin，AMK)，蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，兔抗p62、鼠抗Lc3(MBL公司)，鼠抗β-actin(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，兔二抗、鼠二抗(Abgent公司)。主要儀器包括體視顯微鏡(Olympus sz61)，HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱，分光光度計(棱光)，Allegra X-15R低溫高速離心機(Beckman-Coulter公司)，熒光顯微鏡(Zeiss-Imager.M2)，酶標儀(Biotek)，PowerPac Basic電泳儀(Bio-Rad公司)，H600透射電子顯微鏡(Hitachi公司)。

1.2 方法

1.2.1斑馬魚飼養(yǎng)將野生型AB品系斑馬魚胚胎放入Holtfreter Buffer(60 mmol/L NaCl、0.67 mmol/L KCl、1.3 mmol/L CaCl2、0.3 mmol/L NaHCO3，pH 7.0)培養(yǎng)液中，置于28.5 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，按光照14 h、黑暗10 h的條件培養(yǎng)，及時換液并在體視顯微鏡下去除未受精或死亡的胚胎。

1.2.2細菌浸染實驗參照文獻[6]，挑單個菌落至3 ml LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)14～16 h至對數(shù)生長期。按1∶10重新接種于DMEM培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。收集菌液離心后用滅菌的Holtfreter Buffer培養(yǎng)液洗3次后重懸，測定600 nm處的光密度(optical density，OD)值以求菌液密度，同時做平板菌落計數(shù)。用Holtfreter Buffer稀釋菌液至1×1010CFU/ml、5×109CFU/ml、1×109CFU/ml、5×108CFU/ml、5×107CFU/ml、5×106CFU/ml，浸染72 hpf斑馬魚。每個劑量感染20條斑馬魚，連續(xù)觀察7 d，計數(shù)斑馬魚的死亡數(shù)，并繪制存活率曲線。

1.2.3熒光顯微鏡實時監(jiān)測根據(jù)上述實驗結(jié)果，用1×109CFU/ml GFP-UF110感染72 hpf幼年斑馬魚，于感染后不同時間點收集斑馬魚，在熒光顯微鏡下觀察細菌的入侵狀況。觀察的胚胎和幼魚在24 hpf前用0.003%的PTU處理以阻止黑色素產(chǎn)生。

1.2.4細菌計數(shù)根據(jù)上述實驗結(jié)果，用1×109CFU/ml細菌感染斑馬魚，分別在感染6、8、10、12、14、16和24 h后計數(shù)斑馬魚體內(nèi)的細菌量。參照文獻[6]，每組10條斑馬魚，用無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次,然后用100 μl PBS將其研磨均勻，取50 μl研磨液稀釋后直接加入軟瓊脂中傾注SS平板，37 ℃培養(yǎng)過夜,計數(shù)平板上有黑色中心的細菌數(shù)即每條魚體感染的細菌量；剩余50 μl研磨液在AMK(100 μg/ml)中28.5 ℃孵育2 h殺死胞外菌，稀釋后加入軟瓊脂中傾注SS平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，計數(shù)細菌數(shù)即侵入細胞內(nèi)的細菌量。以上每組均設(shè)3個平行組。

1.2.5蛋白免疫印跡法檢測自噬蛋白Lc3及p62將細菌與斑馬魚共培養(yǎng)一定時間后，收集斑馬魚，加入裂解液研磨后測定蛋白濃度。取60 μg樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)(濃縮膠90 V，30 min；分離膠110 V，90 min)；電泳完成后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上(200 mA，75 min)。5%脫脂奶粉室溫封閉90 min；加入鼠抗β-actin(1∶3 000)、鼠抗Lc3(1∶1 500)和兔抗p62(1∶1 500)，4 ℃孵育過夜。次日室溫孵育1 h，用含吐溫20的Tris緩沖液(Tris buffered saline with Tween-20， TBST)洗3次；加入鼠二抗(1∶3 000)、兔二抗(1∶3 000)，室溫孵育90 min，TBST洗3次?；瘜W發(fā)光法顯影，檢測Lc3和p62蛋白的表達。

1.2.6透射電子顯微鏡觀察自噬體收集感染后的幼年斑馬魚，用PBS洗2～3次。參照文獻[7]，用2.5%戊二醛與2%多聚甲醛混合固定液固定4 h以上。PBS洗后，鋨酸固定1 h，然后依次進行梯度丙酮脫水、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片機切片、醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，最后在透射電子顯微鏡下觀察自噬體結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學處理，多組平均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌-斑馬魚感染模型適宜菌量的確定

用不同密度鼠傷寒沙門菌浸染72 hpf斑馬魚，斑馬魚在7 d內(nèi)的存活率曲線顯示，1×1010CFU/ml和5×109CFU/ml細菌量分別使斑馬魚于感染第1、2天開始死亡； 1×109CFU/ml細菌量感染2 d內(nèi)對斑馬魚無顯著影響，感染后3 d該魚出現(xiàn)尾巴卷曲、游動時協(xié)調(diào)性和靈活能力下降的癥狀，并有死亡現(xiàn)象。5×108CFU/ml、5×107CFU/ml、5×106CFU/ml細菌量分別使斑馬魚在感染后4、5 d出現(xiàn)死亡，但死亡率較低，表明這3個密度對斑馬魚影響較小(圖1)。根據(jù)研究目的，選擇感染后2 d內(nèi)對斑馬魚存活無顯著影響的1×109CFU/ml為后續(xù)實驗用細菌量。

圖1 不同密度鼠傷寒沙門菌感染斑馬魚的存活率曲線Fig.1 The survival of zebrafish larvae infected by different doses of S. typhimurium

2.2 沙門菌在斑馬魚體內(nèi)的播散

1×109CFU/ml GFP-UF110感染72 hpf幼年斑馬魚后，熒光顯微鏡實時監(jiān)測結(jié)果顯示，感染后4 h斑馬魚口周及卵黃囊中均有細菌侵入(圖2B)，8 h斑馬魚腸道中可檢測到細菌信號(圖2C)， 此后細菌逐步播散，1 d后眼睛周圍及頭部出現(xiàn)綠色細菌信號(圖2D)，2 d后播散至斑馬魚整個頭部(圖2E)，3 d后遍布斑馬魚全身(圖2F)。

Real-time analysis of S. typhimurium in zebrafish larvae after infection. Zebrafish larvae were immersed in 1×109 CFU/ml of S. typhimurium expressing GFP at 72 hpf. A: Uninfected zebrafish larva. B: 4 h after infection. C: 8 h after infection. D: 1 d after infection. E: 2 d after infection. F: 3 d after infection. Pictures were taken with an epifluorescence Zeiss microscope. Scale bar, 100 μm.

收集感染后6、8、10、12、14、16和24 h的斑馬魚進行AMK殺菌實驗。細菌計數(shù)結(jié)果顯示，未加AMK組整條魚體感染的細菌量隨時間延長而增加，感染后10 h細菌量顯著高于8 h(圖3A)；加入AMK殺死胞外菌后，細菌量明顯降低，且感染后10 h魚體中侵入細胞內(nèi)的細菌量顯著低于8 h(圖3B)，表明此階段幼魚體內(nèi)發(fā)生了較強的抵御細菌入侵或殺滅細菌的保護性反應。

The number of bacteria in the whole-larvae is increasing after infection over time, but not the intracellular bacterial number. Triplicate groups of five larvae were analyzed for each biological replicate represented by a single dot. A: Whole-larvae bacterial number from 6 h to 24 h after infection. B: Intracellular bacterial number from 6 h to 24 h after infection. ***P<0.001.

2.3 沙門菌-斑馬魚感染模型中自噬的變化

從感染后8～10 h，胞內(nèi)細菌量明顯下降，為檢測此現(xiàn)象與自噬的關(guān)系，用蛋白免疫印跡法檢測感染后不同時間點幼年斑馬魚自噬相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果顯示，細菌與斑馬魚共作用8 h后，自噬標記蛋白Lc3-Ⅱ的表達顯著高于對照組及其他時間點，自噬底物p62蛋白的表達則顯著降低；感染后10 h上述趨勢仍存在，但差異不顯著(圖4A)。結(jié)果表明，自噬過程可能影響了此階段侵入幼魚細胞內(nèi)細菌的繁殖。

收集未感染及感染8 h的幼年斑馬魚，用固定液固定后制備超薄切片。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未感染幼年斑馬魚體內(nèi)未見明顯的自噬體結(jié)構(gòu)(圖5A)；感染后8 h幼魚體內(nèi)可觀察到腫脹的線粒體結(jié)構(gòu)，表明細菌感染引起幼魚體內(nèi)變化，同時還觀察到包裹著細菌的雙層膜自噬體結(jié)構(gòu)及降解內(nèi)容物的單層膜自噬溶酶體結(jié)構(gòu)(圖5B、C)。

Zebrafish larvae were treated with 1×109 CFU/ml UF110 for different hours. A: Total lysate was prepared and subjected to immunoblot analysis. B: Relative ratio of Lc3-Ⅱ/β-actin was quantified. C: Relative ratio of p62/β-actin was quantified. *P<0.05, **P<0.01.

Transmission electron micrographs of zebrafish larvae at 80 hpf. Sections are transverse through the yolk in the region of intestinal bulb. A: Uninfected zebrafish larvae. B and C: 8 h after infection. Black arrowhead shows the clear double membrane. Black arrow shows the bacterium. White arrow shows the autolysosome. White arrowhead shows the swelling of mitochondria. Scale bar, 1 μm.

3 討論

作為一種異于凋亡的細胞程序性死亡方式，自噬正日益受到關(guān)注。自噬是真核細胞特有的生命現(xiàn)象，經(jīng)起始、成核、延伸和成熟4個階段，形成一個包裹著長壽命蛋白、破損細胞器或外來異物等的雙層膜泡結(jié)構(gòu)——自噬體[8]。最終自噬體與溶酶體融合將內(nèi)容物降解，實現(xiàn)細胞本身需要的代謝及細胞器的更新[9]。自噬不僅參與細胞生長發(fā)育、成熟分化及死亡調(diào)控過程，還是細胞對外界不良刺激的一種防御機制[10]。自噬異常會導致多種疾病的發(fā)生，如神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、糖尿病、新陳代謝紊亂、擴張性心肌病和病原體感染等[8]。此外，自噬途徑涉及天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的諸多方面，一方面可通過形成自噬溶酶體清除入侵的微生物，發(fā)揮天然抗感染免疫作用；另一方面可通過參與抗原加工、呈遞過程，在獲得性免疫中發(fā)揮作用[11]。因此，當發(fā)生病毒入侵或細菌感染時，自噬能及時捕捉并降解這些病原體以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[12,13]。

Lc3是酵母atg8基因的同源物，參與早期自噬體的形成，主要有Lc3-Ⅰ和Lc3-Ⅱ兩種形式。Lc3-Ⅰ是胞質(zhì)可溶性的，在自噬未發(fā)生上調(diào)時常規(guī)表達；當自噬發(fā)生時，經(jīng)泛素化修飾后，與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)結(jié)合，成為膜結(jié)合形式的Lc3-Ⅱ。Lc3-Ⅱ主要存在于前自噬體和自噬體上，是自噬體的標記，其含量與自噬泡數(shù)目呈正相關(guān)，在一定程度上反映了自噬水平[14]。蛋白免疫印跡法檢測Lc3-Ⅱ表達量可確定自噬水平，是一種簡單、有效的檢測自噬活性及自噬通量的方法。p62既是一種接頭蛋白，又是一種自噬底物蛋白。作為接頭蛋白，其一端結(jié)合泛素化的蛋白，一端與Lc3相連，參與自噬體形成[15]。作為自噬底物蛋白，其能被自噬過程有效降解[16,17]。當自噬活性升高時，p62 mRNA表達水平不變，蛋白卻降解[18]。因此，p62蛋白表達水平與自噬活性呈負相關(guān)[15-18,19]。

斑馬魚是研究自噬功能與機制的良好模型[5,20]。科學家發(fā)現(xiàn)參與自噬的基因和蛋白在48 hpf胚胎中的表達顯著增高，自噬的上調(diào)發(fā)生在胚胎發(fā)育至第2、3天的咽裂期[5]。72 hpf斑馬魚已破膜而出進入“幼魚”階段，能自由移動并開始主動覓食[4]，此時用不同密度細菌對其進行浸染實驗，根據(jù)斑馬魚2 d內(nèi)的死亡情況選擇1×109CFU/ml細菌量為后續(xù)實驗菌量。幼年斑馬魚通體透明，可實時監(jiān)控其與病原菌的相互作用；而用小鼠感染模型進行活體監(jiān)測相對困難。本實驗用GFP標記的鼠傷寒沙門菌感染斑馬魚后，發(fā)現(xiàn)感染后4 h斑馬魚體內(nèi)有細菌入侵，此后逐步播散，直至3 d遍布全身。

最近科學家利用靜脈注射的方法構(gòu)建了福氏志賀菌-斑馬魚感染模型，發(fā)現(xiàn)在感染后4 h和24 h時斑馬魚體內(nèi)均有自噬發(fā)生，且p62在此過程中發(fā)揮了不可或缺的作用。該實驗還發(fā)現(xiàn)，自噬激活劑西羅莫司(rapamycin，雷帕霉素)在此模型中并未發(fā)揮促進清除細菌和保護斑馬魚的作用[20]。靜脈注射法雖能保證感染細菌量的精確性，但浸染法作用溫和，且更接近自然感染狀態(tài)。本實驗用1×109CFU/ml鼠傷寒沙門菌浸染72 hpf幼年斑馬魚，發(fā)現(xiàn)8～10 h侵入細胞內(nèi)的細菌數(shù)逐漸減少；此階段自噬相關(guān)蛋白Lc3-Ⅱ表達顯著增高，自噬底物蛋白p62水平顯著降低，且在感染后8 h幼魚細胞中觀察到自噬體和自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。細菌引起的異源自噬發(fā)生時，雙層膜的自噬體結(jié)構(gòu)能將細菌包裹起來，最終在自噬溶酶體中將其降解，從而減少細菌數(shù)目，減輕感染。上述結(jié)果表明，自噬在抵御胞內(nèi)細菌的生長和繁殖中發(fā)揮了重要作用，自噬水平的提高可能是斑馬魚抗鼠傷寒沙門菌感染的一種機制。

本研究用鼠傷寒沙門菌浸染幼年斑馬魚，建立的沙門菌-斑馬魚感染模型可用于自噬的研究，該模型簡單、方便、易于操作。鑒于斑馬魚在研究病原菌感染方面的優(yōu)勢，下一步擬利用該模型探究某些藥物(如自噬激活劑Torin1、自噬抑制劑氯喹等)對斑馬魚異源自噬的影響。此外，用斑馬魚構(gòu)建突變品系相對容易，該模型將對進一步明確沙門菌誘導體內(nèi)自噬的發(fā)生機制提供便利，為抑制或殺滅入侵體內(nèi)的沙門菌提供新思路。

[1] Benjamin JL, Sumpter R Jr, Levine B, Hooper LV. Intestinal epithelial autophagy is essential for host defense against invasive bacteria [J]. Cell Host Microbe, 2013, 13(6): 723-734.

[2] Conway KL, Kuballa P, Song JH, Patel KK, Castoreno AB, Yilmaz OH, Jijon HB, Zhang M, Aldrich LN, Villablanca EJ, Peloquin JM, Goel G, Lee IA, Mizoguchi E, Shi HN, Bhan AK, Shaw SY, Schreiber SL, Virgin HW, Shamji AF, Stappenbeck TS, Reinecker HC, Xavier RJ. Atg16L1 is required for autophagy in intestinal epithelial cells and protection of mice from Salmonella infection [J]. Gastroenterology, 2013, 145(6):1347-1357.

[3] Fleming A, Rubinsztein DC. Zebrafish as a model to understand autophagy and its role in neurological disease [J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1812(4): 520-526.

[4] Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of embryonic development of the zebrafish [J]. Dev Dyn, 1995, 203(3): 253-310.

[5] Cui J, Sim TH, Gong Z, Shen HM. Generation of transgenic zebrafish with liver-specific expression of EGFP-Lc3: a new in vivo model for investigation of liver autophagy [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 422(2): 268-273.

[6] Oehlers SH, Flores MV, Hall CJ, Swift S, Crosier KE, Crosier PS. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish [J]. Dis Models Mech, 2011, 4(6): 832-841.

[7] Boglev Y, Badrock AP, Trotter AJ, Du Q, Richardson EJ, Parslow AC, Markmiller SJ, Hall NE, de Jong-Curtain TA, Ng AY, Verkade H, Ober EA, Field HA, Shin D, Shin CH, Hannan KM, Hannan RD, Pearson RB, Kim SH, Ess KC, Lieschke GJ, Stainier DY, Heath JK. Autophagy induction is a Tor- and Tp53-independent cell survival response in a zebrafish model of disrupted ribosome biogenesis [J]. PLoS Genet, 2013, 9(2):e1003279.

[8] Tanida I. Autophagosome formation and molecular mechanism of autophagy [J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 14(11): 2201-2214.

[9] Liu H, He ZY, Simon HU. Targeting autophagy as a potential therapeutic approach for melanoma therapy [J]. Semin Cancer Biol, 2013, pii:S1044- 579X(13)00059-X.

[10] Monastyrska I, Klionsky DJ. Autophagy in organelle homeostasis: peroxisome turnover [J]. Mol Aspects Med, 2006, 27 (5-6): 483-494.

[11] 李瓊,吳淑燕,黃瑞.自噬在抗原加工呈遞中作用的研究進展[J].微生物與感染，2010, 5(4):243-247.

[12] Shahnazari S, Brumell JH. Mechanisms and consequences of bacterial targeting by the autophagy pathway [J]. Curr Opin Microbiol, 2011, 14(1):68-75.

[13] Jo EK, Yuk JM, Shin DM, Sasakawa C. Roles of autophagy in elimination of intracellular bacterial pathogens [J]. Front Immunol, 2013, 4: 97.

[14] 秦正紅,樂衛(wèi)東.自噬:生物學與疾病[M].北京:科學出版社,2011: 49-51.

[15] Ishimura R, Tanaka K, Komatsu M. Dissection of the role of p62/Sqstm1 in activation of Nrf2 during xenophagy [J]. FEBS Lett, 2014, 588(5): 822-828.

[16] Johansen T, Lamark T. Selective autophagy mediated by autophagic adapter proteins [J]. Autophagy, 2011, 7(3): 279-296.

[17] Bj?rk?y G, Lamark T, Brech A, Outzen H, Perander M, Overvatn A, Stenmark H, Johansen T. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death [J]. J Cell Biol, 2005, 171(4): 603-614.

[18] Luo S, Garcia-Arencibia M, Zhao R, Puri C, Toh PP, Sadiq O, Rubinsztein DC. Bim inhibits autophagy by recruiting Beclin 1 to microtubules [J]. Mol Cell, 2012, 47(3): 359-370.

[19] Mizushima N, Yoshimori T, Levine B. Methods in mammalian autophagy research [J]. Cell, 2010, 140(3): 313-326.

[20] Mostowy S, Boucontet L, Mazon Moya MJ, Sirianni A, Boudinot P, Hollinshead M, Cossart P, Herbomel P, Levraud JP, Colucci-Guyon E. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy [J]. PLoS Pathog, 2013, 9(9): e1003588.