鮑磊，李濤，盧水華，張文宏

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040； 2. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

Keywords: Child; Pulmonary tuberculosis; Interferon γ release assay

結(jié)核病是威脅人類健康的主要傳染病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約1/3人口受結(jié)核分枝桿菌感染。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2013年報(bào)道，2012年全球仍有860萬新發(fā)病例，其中53萬例為兒童[1]。中國(guó)盡管有較高的卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)接種率，但每年仍有100萬左右新發(fā)病例。因此，準(zhǔn)確診斷結(jié)核病并規(guī)范治療，對(duì)控制結(jié)核病的流行非常重要。

結(jié)核病的診斷較復(fù)雜，由于結(jié)核分枝桿菌與BCG及環(huán)境中其他非結(jié)核分枝桿菌存在交叉反應(yīng)，過去100多年廣泛使用的結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test, TST)在中國(guó)這樣的BCG高接種地區(qū)使用價(jià)值有限[2,3]。γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon γ release assay, IGRA)是近10年來發(fā)展的新型結(jié)核病診斷手段。與TST使用的純化蛋白衍生物不同，IGRA使用的2種抗原是由結(jié)核分枝桿菌特有的基因序列RD1編碼產(chǎn)生，包括6 kDa早期分泌抗原靶分子(early secreted antigenic target of 6 kDa，ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)。體外使用這2種抗原刺激機(jī)體特異性T細(xì)胞，產(chǎn)生并釋放γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)，檢測(cè)釋放的IFN-γ可輔助結(jié)核病診斷。由于RD1只存在于結(jié)核分枝桿菌的基因序列中，假陽性結(jié)果減少，因此IGRA較傳統(tǒng)TST具有更高的特異度[4]。

目前IGRA商用試劑盒有2種：QuantiFERON-Gold In-Tube(QFT-GIT)和T-SPOT.TB。前者主要通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后釋放的IFN-γ濃度，后者通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)檢測(cè)抗原刺激后產(chǎn)IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)。與T-SPOT.TB相比，QFT-GIT不需分離外周血單核細(xì)胞，操作更簡(jiǎn)單方便。這2項(xiàng)檢測(cè)方法用于結(jié)核病診斷，主要集中在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的低發(fā)病率國(guó)家，在結(jié)核病高發(fā)地區(qū)尤其是在兒童中的使用較少[5,6]。有報(bào)道顯示，在歐洲結(jié)核病低發(fā)國(guó)家，與傳統(tǒng)TST相比，IGRA在兒童結(jié)核病診斷中并無明顯優(yōu)勢(shì)[7,8]。中國(guó)作為結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，有較高的BCG接種率，本研究主要探討QFT-GIT和T-SPOT.TB在這一地區(qū)兒童肺結(jié)核診斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2010年12月～2011年8月就診于上海市公共衛(wèi)生臨床中心和復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，具有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等癥狀，伴或不伴發(fā)熱、盜汗、消瘦、乏力等全身表現(xiàn)，臨床懷疑肺結(jié)核的16歲以下患兒共45例，抽取靜脈血行QFT-GIT檢測(cè)。選取2012年4月～2012年12月就診于上海市公共衛(wèi)生臨床中心，同樣具有上述臨床表現(xiàn)的16歲以下患兒共69例，抽取靜脈血行T-SPOT.TB檢測(cè)。所有入組患兒的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)檢測(cè)均為陰性，均接種過BCG。檢測(cè)結(jié)果不影響臨床治療方案的制訂。收集每例患兒的基本信息、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、影像學(xué)資料、病理報(bào)告、治療方案等相關(guān)信息，根據(jù)表1的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷和分類[9]。

1.2 QFT-GIT和T-SPOT.TB

QFT-GIT試劑盒(澳大利亞Cellestis公司)包括陰性對(duì)照管、陽性對(duì)照管﹝(包被植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)﹞及TB抗原管(分別包被ESAT-6、CFP-10、TB7.7)。首先，每個(gè)采血管各收集1 ml全血，搖晃混勻后于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h，離心并收集上清液。ELISA檢測(cè)上清液中的IFN-γ濃度。TB抗原管中的IFN-γ濃度減去陰性對(duì)照管中的IFN-γ濃度作為結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的IFN-γ量。當(dāng)該差值≥0.35 IU/ml且≥25%陰性對(duì)照管數(shù)值，結(jié)果判為陽性。差值<0.35 IU/ml或≥0.35 IU/ml但<25%陰性對(duì)照管，同時(shí)陽性對(duì)照管減去陰性對(duì)照管≥0.5 IU/ml，結(jié)果判為陰性。差值<0.35 IU/ml或≥0.35 IU/ml但<25%陰性對(duì)照管，同時(shí)陽性對(duì)照管減去陰性對(duì)照管<0.5 IU/ml；或陰性對(duì)照管>8.0 IU/ml，為結(jié)果不確定。

T-SPOT.TB(英國(guó)Oxford Immunotec公司)主要通過ELISPOT檢測(cè)ESAT-6和CFP-10刺激后產(chǎn)IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)。采集外周血后，分離外周血單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2.5×105，分別加入空白對(duì)照孔、抗原A(ESAT-6)孔、抗原B(CFP-10)孔和陽性對(duì)照(PHA)孔，37 ℃孵育16～20 h后讀數(shù)。當(dāng)空白對(duì)照孔計(jì)數(shù)≤5，且抗原A或抗原B孔計(jì)數(shù)減去空白對(duì)照孔的數(shù)值 > 6； 或當(dāng)空白對(duì)照孔計(jì)數(shù)>5個(gè)，且抗原A或抗原B孔計(jì)數(shù)至少為空白對(duì)照孔計(jì)數(shù)2倍時(shí)，結(jié)果為陽性(圖1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

將確診肺結(jié)核和高度懷疑肺結(jié)核組的患者作為肺結(jié)核患者，排除肺結(jié)核組的患者作為非結(jié)核患者，疑似肺結(jié)核組因最終診斷不明確，未納入數(shù)據(jù)分析。計(jì)算QFT-GIT和T-SPOT.TB的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值(positive predictive value，PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(negative predictive value，NPV)、陽性似然比、陰性似然比，其中QFT-GIT檢測(cè)的不確定結(jié)果納入靈敏度和特異度計(jì)算?？ǚ綑z驗(yàn)用于比較QFT-GIT與T-SPOT.TB診斷兒童肺結(jié)核的差異，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有統(tǒng)計(jì)均用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 基本信息

45例臨床懷疑肺結(jié)核的患兒行QFT-GIT檢測(cè)，69例行T-SPOT.TB檢測(cè)。收集相關(guān)信息后，根據(jù)表1的診斷分類標(biāo)準(zhǔn)， 分為4個(gè)組。其中3例

圖1 T-SPOT.TB 操作示意圖Fig.1 Operation chart of T-SPOT.TB

表1 肺結(jié)核診斷分類標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Diagnostic classification of pulmonary tuberculosis

QFT-GIT檢測(cè)和6例T-SPOT.TB檢測(cè)的患兒，因歸入疑似肺結(jié)核組， 故未納入最后統(tǒng)計(jì)分析。其余105例患兒中，41例為確診肺結(jié)核，其中21例行QFT-GIT檢測(cè)、20例行T-SPOT.TB檢測(cè)；32例為高度懷疑肺結(jié)核，其中5例行QFT-GIT檢測(cè)、27例行T-SPOT.TB檢測(cè)；32例排除肺結(jié)核的兒童，16例行QFT-GIT檢測(cè)，16例行T-SPOT.TB檢測(cè)(圖2)。每組兒童年齡、性別、臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)、BCG接種情況、治療藥物等相關(guān)信息見表2。

2.2 QFT-GIT和T-SPOT.TB的檢測(cè)結(jié)果

確診肺結(jié)核的41例患兒中，18例QFT-GIT檢測(cè)陽性，14例T-SPOT.TB檢測(cè)陽性；高度懷疑肺結(jié)核組中，4例QFT-GIT檢測(cè)陽性，20例T-SPOT.TB檢測(cè)陽性。這兩組中的QFT-GIT和T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率均達(dá)70%以上。排除肺結(jié)核的兒童中，2例QFT-GIT檢測(cè)陽性，1例QFT-GIT檢測(cè)結(jié)果不確定，1例T-SPOT.TB檢測(cè)陽性。具體結(jié)果見表3。

PTB, pulmonary tuberculosis.

表2 入組兒童基本信息Tab.2 Demographic and clinical information of recruited children

表3 QFT-GIT和T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Results of QFT-GIT and T-SPOT.TB

2.3 QFT-GIT和T-SPOT.TB的診斷價(jià)值

比較這2種方法的靈敏度、特異度、PPV、NPV、陽性似然比和陰性似然比，結(jié)果顯示QFT-GIT用于診斷兒童肺結(jié)核的靈敏度為84.6%(95% CI 為65.9%～94.5%)，特異度為81.3%(95% CI為52.6%～94.2%)；與QFT-GIT比較，T-SPOT.TB的靈敏度低(72.3%，95% CI 為58.1%～83.2%)，特異度高(93.7%，95% CI為69.7%～99.9%)。2種檢測(cè)方法的PPV均達(dá)90%以上(91.7%vs. 97.1%)(表 4)。此外，11例QFT-GIT檢測(cè)和5 例 T-SPOT.TB檢測(cè)的患兒在IGRA檢測(cè)前1個(gè)月內(nèi)接受過激素治療(1 mg·kg-1·d-1)。比較使用激素與未使用激素的兒童，發(fā)現(xiàn)激素治療后27.3%(3/11)患兒QFT-GIT結(jié)果陰性，其陽性率較未治療組降低(72.7%vs. 93.3%)； 40.0%(2/5)患兒T-SPOT.TB結(jié)果陰性，假陰性率較未治療者增加(40.0%vs. 26.2%)。

表4 QFT-GIT和T-SPOT.TB在兒童肺結(jié)核中的診斷價(jià)值Tab.4 Diagnostic value of QFT-GIT and T-SPOT.TB in childhood pulmonary tuberculosis

3 討論

結(jié)核分枝桿菌涂片和培養(yǎng)陽性是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[10]，但結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)至少需2周才能獲得陽性結(jié)果，而約50%培養(yǎng)陽性患者的涂片結(jié)果為陰性[11]。因此，開發(fā)更準(zhǔn)確、更快速的診斷方法對(duì)提高結(jié)核病的早期診斷率有重要意義。2001年，QuantiFERON-TB被美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administrator，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于結(jié)核分枝桿菌感染的輔助診斷后，越來越多的研究將目光投向該領(lǐng)域[12]。目前關(guān)于IGRA在結(jié)核病中的應(yīng)用多集中于發(fā)達(dá)國(guó)家的成人中，在兒童中的研究較少。

本研究結(jié)果顯示，QFT-GIT用于診斷兒童肺結(jié)核的靈敏度較T-SPOT.TB高(84.6%vs. 72.3%)，而T-SPOT.TB的特異度則比QFT-GIT高(93.7%vs. 81.3%)。2種檢測(cè)方法的PPV均超過90%(91.7%vs. 97.1%)。浙江省成人肺結(jié)核診斷研究顯示，IGRA的PPV為88.2%[13]。由于潛伏性結(jié)核的感染比例隨年齡增長(zhǎng)而逐漸增加，因此兒童中IGRA更少受潛伏性結(jié)核感染的影響。本研究顯示， 2種IGRA檢測(cè)方法診斷兒童肺結(jié)核的PPV均較成人高。T-SPOT.TB的陽性似然比高達(dá)11.5，與QFT-GIT相比，更適合于兒童肺結(jié)核的診斷。

激素有抑制機(jī)體免疫反應(yīng)的作用，長(zhǎng)期以來人們一直認(rèn)為其對(duì)IGRA結(jié)果存在負(fù)面影響，但有關(guān)報(bào)道較少[14]。本研究中，11例QFT-GIT檢測(cè)和5例T-SPOT.TB檢測(cè)患兒在IGRA檢測(cè)前1個(gè)月內(nèi)接受過激素治療，2種檢測(cè)的假陰性率分別增加至27.3%和40.0%。盡管這一差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但提示激素治療會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，建議一旦懷疑結(jié)核分枝桿菌感染，應(yīng)在使用激素前盡早行IGRA檢測(cè)。受樣本量的限制，本研究結(jié)果可能有一定的偏倚，故需擴(kuò)大樣本量以證實(shí)這一結(jié)論。

綜上所述，QFT-GIT和T-SPOT.TB在中國(guó)這一BCG高接種、結(jié)核病高發(fā)地區(qū)用于兒童肺結(jié)核診斷的PPV較高，具有較高的肺結(jié)核輔助診斷價(jià)值。

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