秦俊哲， 任金玫， 殷 紅

0 引言

桑黃(Phellinuslinteus),擔子菌亞門多孔菌科針層孔菌屬真菌，是一種珍貴的藥用真菌[1]，最早記載于李時珍《本草綱目》，而桑黃多糖為桑黃的

主要功效成分[2]，其藥理作用主要有抗癌、增強免疫力[3]、抗纖維化[4]、降血糖[5]等.目前有很多關(guān)于桑黃多糖的提取工藝的研究報道，但有關(guān)微波輔助提取桑黃子實體多糖的工藝研究，鮮有報道.微波輔助提取技術(shù)是近年來新發(fā)展起來的一種方法，相比于傳統(tǒng)的提取方法，具有提取效率高、選擇性高等優(yōu)點[6]，現(xiàn)已成功應(yīng)用于天然植物活性成分的提取[7].本實驗將微波輔助提取法應(yīng)用桑黃子實體多糖的提取工藝研究，采用響應(yīng)曲面法(Response Surface Methodology)對微波輔助提取桑黃多糖的工藝進行初步探索并優(yōu)化，為桑黃子實體多糖的提取提供一定的參考.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 原料

桑黃子實體，陜西科技大學微生物實驗室人工培育.

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、苯酚、DNS試劑、濃硫酸、無水乙醇、95%乙醇、丙酮和乙醚，均為分析純.

1.1.3 主要儀器

WD900(MG-5562S)格蘭仕微波爐；TGL-16M高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；756PC紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海榮生有限公司；電熱鼓風干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 桑黃多糖的提取工藝流程

桑黃子實體→粉碎→80%乙醇回流→烘干濾渣→粉碎→過篩→微波提取→抽濾→濃縮→4倍體積醇沉→離心→洗滌→定容→粗多糖溶液.

1.2.2 多糖含量的測定與計算

采用苯酚-硫酸法測定水溶性總糖質(zhì)量,采用DNS法測定還原糖質(zhì)量[8].

多糖質(zhì)量及其得率的計算公式如下[9]：

多糖質(zhì)量(g)=總糖質(zhì)量(g)-還原糖質(zhì)量(g)

多糖得率(%)=[多糖質(zhì)量(g)/原料質(zhì)量(g)]×100%

1.2.3 單因素實驗

影響桑黃多糖得率的因素有很多，現(xiàn)通過單因素實驗選取實驗因素與水平.

1.2.4 微波輔助提取桑黃多糖的工藝優(yōu)化

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設(shè)計原理[10]，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取對微波輔助提取桑黃多糖較顯著的因素，即提取時間、微波功率、料液比，分別用A、B、C表示，實驗設(shè)計如表1所示.

表1 Box-Behnken因子水平編碼表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對桑黃多糖得率的影響

稱取4份桑黃粉末各1 g，選定料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，在微波功率為540 W的條件下提取5 min，結(jié)果如圖1所示.

圖1 料液比對多糖得率的影響

由圖1可知，多糖得率隨著料液比的增加而增大，但增加到1∶40時趨于平穩(wěn)，因此選擇料液比為1∶40左右較適宜.

2.1.2 提取時間對桑黃多糖得率的影響

固定料液比為1∶40，在微波功率為540 W的條件下，考察不同提取時間對多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示.

圖2 提取時間對多糖得率的影響

由圖2可知，隨著提取時間的延長，多糖得率不斷增加.4 min之前增加較為明顯，5 min之后有下降趨勢.可能是因為時間過長，會破壞部分多糖的結(jié)構(gòu)，因此選擇提取時間為5 min左右.

2.1.3 微波功率對桑黃多糖得率的影響

固定料液比為1∶40，在微波功率180 W、360 W、540 W、720 W條件下處理5 min，結(jié)果如圖3所示.

圖3 微波功率對多糖得率的影響

從圖3中看出，多糖得率隨微波功率的增大而呈先升后降趨勢，微波功率540 W時多糖的含量達到最大，功率720 W時多糖含量有降低的趨勢；這可能是因為功率偏低時浸提不完全，而功率過大時會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，故選取微波功率540 W左右較適宜.

2.1.4 提取次數(shù)對桑黃多糖得率的影響

固定料液比為1∶40，在微波功率為540 W時提取5 min，比較不同提取次數(shù)對桑黃多糖得率的影響，結(jié)果如圖4所示.

圖4 提取次數(shù)對多糖得率的影響

由圖4知，浸提第2次比第1次的多糖得率增加顯著，而浸提3次多糖得率增加很少，從經(jīng)濟角度考慮，選擇2次提取為宜.

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

2.2.1 實驗設(shè)計

以桑黃多糖得率為響應(yīng)值(y)，分別以-1、0、1代表自變量的低、中、高水平，設(shè)計3因素3水平實驗，其中1-12是析因?qū)嶒灒?3-17是中心實驗，實驗方案及結(jié)果如表2所示.

表2 響應(yīng)面法設(shè)計與實驗結(jié)果

2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0軟件對實驗結(jié)果進行回歸擬合，得到桑黃多糖得率對以上3個變量的二次多項回歸方程：

Y=4.24+0.016A+0.093B+0.021

C-0.093AB-0.15AC-0.048BC-

0.17A2-0.35B2-0.15C2

回歸模型方差分析如表3所示.

表3 回歸模型方差分析表

表4 回歸方程系數(shù)顯著性分析

注：“***” 差異極顯著(p<0.001)；“**”差異高度顯著(p<0.01).

由表4知，微波功率的一次項達到高度顯著水平(P<0.01)，對多糖產(chǎn)率的影響最大，其次是提取時間與料液比.另外，提取時間與微波功率的交互作用達到高度顯著水平，時間與料液比的交互作用差異極顯著；考察二次項可知，微波功率二次項>時間二次項>料液比二次項，且均達到極顯著水平.

2.2.3 響應(yīng)面分析

圖5 Y=f(A，B)的響應(yīng)面與等高線圖

圖6 Y=f(A，C)的響應(yīng)面與等高線圖

借助Design Expert 8.0軟件，根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面和等高線圖.從等高線中可以直觀判斷兩因素交互作用情況，圓形表示二因交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著[11].本實驗中3個因素之間交互作用對多糖得率的影響如圖5和圖6所示.從這兩組圖的響應(yīng)面最高點和等高線可以看出，在所選范圍內(nèi)存在極值.由圖5可以得知，液料比為40∶1時，隨著提取時間在4.5～5.5 min之間變化，多糖得率增加并不明顯，當微波功率從360 W增加到720 W時，多糖得率呈先增大后降低的趨勢，因此適當提高微波功率可以提高多糖得率.

從圖6可以看出，當微波功率為540 W時，隨著時間和料液比的增大，桑黃多糖的得率達到最大值，當時間和料液比繼續(xù)增大時，多糖得率降低.

2.2.4 提取工藝條件的確定

通過回歸模型的數(shù)學分析可知，微波輔助提取桑黃多糖的最佳工藝參數(shù)為：提取時間5.1 min，微波功率558 W，料液比為1∶41，在此工藝條件下，桑黃多糖得率的理論值為4.241%.為檢驗響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取桑黃多糖工藝的可靠性，采用已優(yōu)化到的提取條件進行驗證實驗，由于實際操作條件有限，將工藝參數(shù)調(diào)整為：提取時間5.1 min，微波功率540 W，料液比1∶41，提取2次，實驗重復(fù)3次，測得多糖得率為4.18%，與理論預(yù)測值相比，相對誤差在1.4%左右.

因此，基于響應(yīng)面法優(yōu)化得到的微波輔助提取工藝參數(shù)，準確可靠.

3 結(jié)論

本實驗通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取桑黃多糖的工藝條件，并確定最佳的提取工藝參數(shù)為：提取時間5.1 min，微波功率540 W，料液比1∶41，提取次數(shù)為2次，在此條件下，多糖得率可達4.18%.

[1] 陳士瑜,陳 惠.菇菌栽培手冊[M].北京:科學技術(shù)文獻出版社,2003:270-271.

[2] 秦俊哲,劉 華.桑黃功效成分研究的新進展[J].食用菌，2008,30(5):1-2.

[3] 鄭立軍,沈業(yè)壽,季俊虬,等.桑黃胞外多糖藥理活性的初步研究[J].食品科學,2007,28(1): 318-321.

[4] 張萬國，胡晉紅，蔡 溱.桑黃對實驗性肝纖維化大鼠血液動力學的影響[J].解放軍藥學學報,2002,18(6):341-342.

[5] Hwang H J,Kim S W,Lim J M,et al.Hypoglycemic effect of crude exopolysaccharides produced by a medicinal mushroom Phellinus baumii in strep tozotocin-include diabetic rats[J].Life Sciences,2005,76:3 069-3 080.

[6] 龔志華,梁 丹,張志博,等.微波輔助提取茶籽皂苷的研究[J].茶葉科學,2013,33(4):358-363.

[7] 陳業(yè)高,海麗娜,畢先鈞.微波輻射在天然藥用活性成分提取分離中的應(yīng)用[J].微波學報,2003,19(2):85-89.

[8] 大連輕工業(yè)學院,華南理工大學,西北輕工業(yè)學院,等.食品分析[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1996:174-177.

[9] 程 偉,秦俊哲,杜軍國,等.桑黃多糖超聲波協(xié)同纖維素酶法提取的工藝優(yōu)化[J].現(xiàn)代食品科技,2012,28(6):662-666.

[10] 慕運動.響應(yīng)面方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].鄭州工程學院學報,2011,22(3):92-94.

[11] 王允樣,呂鳳霞,陸兆新.杯傘發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2004,27(3):89-94.