豬脾轉(zhuǎn)移因子的制備與生物學(xué)特性研究

寧豫昌，喬宏興，馬輝

摘要：試驗(yàn)采用透析法提取了豬脾轉(zhuǎn)移因子（TF），并對(duì)其理化特性、生物安全性以及其對(duì)非特異性和特異性免疫的影響等方面進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，利用透析法制備的豬脾TF能夠顯著（P<0.05）增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力；對(duì)于E玫瑰花環(huán)的形成數(shù)和形成率具有極顯著（P<0.01）的促進(jìn)作用；將豬脾TF與豬瘟疫苗同時(shí)使用，能夠顯著（P<0.05）提高機(jī)體體液免疫的抗體滴度。此外，制備的豬脾TF安全無(wú)毒、無(wú)抗原性，不會(huì)使異種動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)抗體。表明豬脾TF對(duì)于機(jī)體的特異性和非特異性免疫均有促進(jìn)作用，是一種安全的生物免疫調(diào)節(jié)劑。

關(guān)鍵詞：豬脾轉(zhuǎn)移因子（TF）；理化特性；生物安全性

中圖分類號(hào)：S852.4；S859.79+7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）07-1612-04

Preparation of Transfer Factor of Porcine Spleen and Its Biological Characteristics

NING Yu-chang，QIAO Hong-xing，MA Hui

（Henan University of Animal Husbandry and Economy， Zhengzhou 450011， China）

Abstract：The transfer factors（TFs） of porcine spleen were extracted by dialysis method and studied on the physical and chemical properties， biological security， and its effects on non-specific and specific immune. The results showed that TFs significantly enhanced the mouses peritoneal macrophage phagocytosis （P<0.05），and extremely increased the E rosette formation number and rate（P<0.01）. Used with classical swine fever vaccine， the antibody titer of humoral immunity prominently increased（P<0.05）. In addition，the extracted TFs was safe and non-antigenic. The disparate animals had no antibodies produced. It is indicated that TFs of porcine spleen could promote the body's non-specific and specific immune， and was a safe biological immunomodulators. With the further research of TFs，the application of it in controlling animal disease will be more extensive.

Key words： transfer factor（TF）； physical and chemical property； biological safety

轉(zhuǎn)移因子（Transfer factor，TF）自1949年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)[1]，已被人們廣泛研究。TF是存在于人和動(dòng)物白細(xì)胞中的可透析小分子物質(zhì)，能將供體所具有的細(xì)胞免疫功能轉(zhuǎn)移給受體，從而非特異性地增強(qiáng)受體的免疫功能[2]。此外，TF還可以通過(guò)T細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)B細(xì)胞，縮短機(jī)體的免疫應(yīng)答期，產(chǎn)生較高滴度的抗體[3-5]。TF的成分主要包括低聚核苷酸和多肽，相對(duì)分子質(zhì)量約為3 500～5 000，安全無(wú)毒，無(wú)抗原性，且無(wú)種屬差異，是一種新型而又安全的免疫制劑[6]。國(guó)內(nèi)外已將TF用于人醫(yī)臨床治療，并取得一定的效果。目前也有將TF用于臨床獸醫(yī)的研究和應(yīng)用方面的報(bào)道，如將TF用于雞、豬、牛等動(dòng)物疫病控制及免疫調(diào)節(jié)方面[7-9]?？傊?，TF在獸醫(yī)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值和廣闊前景。河南是全國(guó)養(yǎng)豬大省，每年伴隨生豬屠宰產(chǎn)生了數(shù)量極大的廢棄物，為了變廢為寶，將屠宰廢棄物轉(zhuǎn)變?yōu)閮r(jià)值較高的生物制品，減少生豬屠宰所造成的環(huán)境污染，本試驗(yàn)對(duì)豬脾TF的制備方法、理化性質(zhì)、生物學(xué)特性以及其對(duì)非特異性和特異性免疫的影響等方面進(jìn)行了研究，以期為TF能夠普遍應(yīng)用于獸醫(yī)臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

豬脾臟：取新鮮、外觀紅潤(rùn)、有光澤的豬脾臟（鄭州肉聯(lián)廠提供），去除表面脂肪和筋膜；試劑：1%雞紅細(xì)胞懸液、綿羊肝素抗凝血（綿羊頸靜脈采血后以10 IU/mL的比例加入肝素鈉）、小牛血清、20%磺基水楊酸、Folin-酚試劑、標(biāo)準(zhǔn)D-核糖、三氯醋酸、二羥基甲苯、無(wú)水三氯化鐵、鹽酸、可溶性淀粉、2%茚三酮溶液、Hanks液（無(wú)鈣、鎂離子，pH7.2）、豬瘟細(xì)胞苗等由鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供；豬瘟正向間接血凝（IHA）抗體檢測(cè)試驗(yàn)盒購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。試驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)小白鼠、家兔購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，試驗(yàn)豬由鄭州天一高科生物技術(shù)有限公司新鄭豬場(chǎng)提供。

1.2 豬脾TF制備工藝

透析法：取新鮮豬脾臟，去除表面脂肪和筋膜，用0.3%苯酚生理鹽水浸洗后，用滅菌生理鹽水清洗3次，剪碎后稱重。加等量滅菌生理鹽水，用高速組織搗碎機(jī)高速勻漿2次，每次1 min，置-20 ℃反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心30 min，取上清液置于透析袋中，用等量去離子水于4 ℃透析24 h，收集透析袋外液，并用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌即得豬脾TF。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.3 豬脾TF理化特性檢測(cè)

觀察提取的豬脾TF的顏色、氣味及表觀性狀，并測(cè)定樣品pH；蛋白質(zhì)反應(yīng)采用磺基水楊酸法，取適量樣品加入等量20%磺基水楊酸，觀察有無(wú)白色混濁物出現(xiàn)；鑒別反應(yīng)采用茚三酮顯色法，取2 mL樣品加入適量2%茚三酮溶液數(shù)滴，加熱后觀察有無(wú)顏色變化；采用Folin-酚法檢測(cè)樣品中多肽含量；參照《中國(guó)生物制品規(guī)程》檢測(cè)樣品中核糖含量[10]；采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品中核苷酸與多肽的比值，判斷標(biāo)準(zhǔn)為樣品在（251±1） nm處有最大吸收度，且OD260 nm/OD280 nm≥2.0。

1.4 豬脾TF的生物學(xué)特性檢測(cè)

1.4.1 毒性試驗(yàn) 取40只小白鼠，平均分成4組，第1組為對(duì)照組，每只小鼠腹腔注射0.20 mL滅菌生理鹽水；第2、3、4組為試驗(yàn)組，分別腹腔注射0.10、0.15、0.20 mL的豬脾TF，連續(xù)觀察7 d，且48 h內(nèi)不得有死亡。

1.4.2 熱原檢驗(yàn) 取家兔9只，平均分為3組，每只測(cè)量正常體溫后15 min內(nèi)自耳緣靜脈緩緩注入預(yù)熱至38 ℃的豬脾TF，劑量為按家兔每千克體重注射2 mL，每隔30 min測(cè)量體溫1次，連測(cè)3次。

1.4.3 抗原性檢驗(yàn) 將制備的豬脾TF與等量不完全弗氏佐劑混合，經(jīng)乳化后制成油包水的乳劑，穩(wěn)定性檢測(cè)合格后，皮下多點(diǎn)注射6只家兔（1 mL/只），每隔1周注射1次，連續(xù)注射4次，第4次注射1周后采血，分離血清，通過(guò)雙向瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)家兔體內(nèi)是否產(chǎn)生相應(yīng)抗體。

1.4.4 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn) 取體重18～22 g的小白鼠30只，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組15只。每只小鼠腹腔注射0.5%淀粉生理鹽水溶液（取0.5 g可溶性淀粉加入適量蒸餾水中并微沸2 min，冷卻后加入0.9 g NaCl并定容至100 mL）0.5 mL，每天1次，連續(xù)注射3次，以誘導(dǎo)試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠腹腔產(chǎn)生巨噬細(xì)胞。之后試驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射自制豬脾TF 2 mL，對(duì)照組注射等量生理鹽水；12 h后，每只小鼠腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液1 mL。間隔1 h后，頸椎脫臼處死小鼠，正中剪開(kāi)腹壁皮膚，經(jīng)腹膜注入生理鹽水1 mL，輕輕按揉鼠腹部1 min，吸出腹腔洗液 0.5 mL，滴于潔凈載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，置37 ℃溫育30 min。用生理鹽水漂洗，除去未粘片細(xì)胞，晾干。油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，并按下列公式計(jì)算巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)。采用t檢驗(yàn)處理吞噬率和吞噬指數(shù)。

吞噬率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/100×100%

吞噬指數(shù)=100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/100

1.4.5 E玫瑰花環(huán)試驗(yàn) 取小鼠肝素抗凝血（小鼠摘眼球采血后以10 IU/mL的比例加入肝素鈉）2 mL，置37 ℃水浴自然沉淀30～40 min，吸取全部血漿（約1 mL），于血漿中加入適量Hanks液，洗滌，1 500 r/min離心5～10 min，棄上清液，重復(fù)洗滌4次，沉淀均勻即為淋巴細(xì)胞懸液。取適量的綿羊肝素抗凝血，加數(shù)倍Hanks液洗滌3次，最后以Hanks液配成10%綿羊紅細(xì)胞懸液，4 ℃保存。取0.1 mL淋巴細(xì)胞懸液，加10%綿羊紅細(xì)胞懸液0.1 mL，加入豬脾TF 0.1 mL作為試驗(yàn)組，對(duì)照組中不加豬脾TF，其余與試驗(yàn)組相同。將試驗(yàn)組和對(duì)照組均置于37 ℃水浴10 min，然后低速離心（600 r/min）5 min，吸棄多余上清液后，置4 ℃冰箱2～4 h。取出后，將沉淀輕輕搖起，加0.8%戊二醛0.1 mL，混勻后4 ℃固定15 min。將干凈玻片用Hanks液沾濕，滴一小滴混懸液，讓其自然散開(kāi)即可。自然干燥后，用姬姆薩-瑞氏液染色，水洗，干燥鏡檢。在顯微鏡下分別計(jì)數(shù)試驗(yàn)組與對(duì)照組E玫瑰花環(huán)形成數(shù)（凡淋巴細(xì)胞周圍結(jié)合3個(gè)或3個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞者即為陽(yáng)性），共檢查200個(gè)淋巴細(xì)胞，并按下列公式計(jì)算E玫瑰花環(huán)形成率。所有數(shù)據(jù)均采用t檢驗(yàn)處理。

E玫瑰花環(huán)形成率=形成花環(huán)的淋巴細(xì)胞數(shù)/淋巴細(xì)胞總數(shù)×100%

1.4.6 豬脾TF對(duì)體液免疫效果的影響 將40頭25日齡仔豬平均分為對(duì)照組與試驗(yàn)組，于免疫前1 d對(duì)每頭仔豬采血，以正向間接血凝試驗(yàn)法測(cè)定每頭豬的豬瘟抗體滴度及各組的平均抗體水平。每頭仔豬注射豬瘟疫苗1頭份，其中試驗(yàn)組每頭仔豬于免疫同時(shí)加注1 mL自制豬脾TF。免疫后21 d再次采血，檢測(cè)每頭豬的豬瘟抗體滴度及各組的平均抗體水平。采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化特性檢測(cè)結(jié)果

所制備的豬脾TF為淡黃色的透明狀液體，并有淡淡的腥味，其pH 6.3；蛋白質(zhì)反應(yīng)未出現(xiàn)混濁或沉淀，說(shuō)明豬脾TF中不含大分子蛋白質(zhì)；在豬脾TF中加入適量茚三酮溶液并加熱后，呈現(xiàn)紫色；利用Folin-酚法以及參照《中國(guó)生物制品規(guī)程》，分別測(cè)得豬脾TF中多肽含量為3.15 mg/mL，核糖含量為13.22 μg/mL；將制備的豬脾TF稀釋15倍后，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)得OD260 nm/OD280 nm=2.09，符合要求。

2.2 生物學(xué)特性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 毒性試驗(yàn) 利用不同劑量豬脾TF對(duì)小白鼠進(jìn)行注射處理，7 d后，試驗(yàn)組及對(duì)照組小白鼠精神、采食等均表現(xiàn)正常，無(wú)一例死亡，經(jīng)剖檢后觀察心臟、肝臟、肺臟、腎臟等臟器均無(wú)明顯異常病變（表1）。證明制備的豬脾TF安全、無(wú)毒，可以在臨床上使用。

2.2.2 熱原檢驗(yàn) 由表2可知，所有家兔在注射豬脾TF后的1.5 h內(nèi)體溫變化均未超過(guò)0.6 ℃，即熱原檢驗(yàn)結(jié)果呈陰性。

2.2.3 抗原性檢驗(yàn) 經(jīng)雙向瓊脂擴(kuò)散法檢驗(yàn)，所制備的豬脾TF未能使家兔體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)抗體，說(shuō)明豬脾TF不具有抗原性。

2.2.4 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn) 通過(guò)鏡檢可發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中發(fā)生吞噬作用的巨噬細(xì)胞明顯較試驗(yàn)組中的少（圖1）。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)、計(jì)算，試驗(yàn)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)與對(duì)照組相比均有明顯提高，且差異顯著（P<0.05）（表3）。

2.2.5 E玫瑰花環(huán)試驗(yàn) 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理可知，加入豬脾TF的試驗(yàn)組中E玫瑰花環(huán)形成數(shù)和E玫瑰花環(huán)形成率較對(duì)照組均有明顯提高，差異極顯著（P<0.01）（表4）。

2.2.6 豬脾TF對(duì)體液免疫效果的影響 由表5可見(jiàn)，免疫前試驗(yàn)組與對(duì)照組的豬瘟抗體平均滴度（用以2為底的對(duì)數(shù)值表示，下同）均為4.45；免疫后21 d，對(duì)照組的抗體平均滴度測(cè)量值達(dá)到5.05，而試驗(yàn)組的抗體平均滴度測(cè)量值則達(dá)到6.35，免疫后分別上升了0.60和1.90，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，兩者差異顯著（P<0.05）。

3 小結(jié)與討論

將新鮮健康豬脾組織經(jīng)高速組織搗碎機(jī)高速勻漿多次，再經(jīng)反復(fù)凍融、離心、透析、過(guò)濾除菌，可制得豬脾TF，此法簡(jiǎn)便、成本低廉、不需要特殊的器材和設(shè)備。此外，由于TF在常溫下易失活，因此，相關(guān)操作（如離心、透析）應(yīng)在低溫下進(jìn)行。利用透析法制備的豬脾TF無(wú)毒性、無(wú)熱原、無(wú)抗原性，符合獸醫(yī)的臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)。但是在實(shí)際生產(chǎn)中，豬脾臟的來(lái)源廣泛，很難確保脾臟組織中不含細(xì)菌、病毒等微生物，而采用過(guò)濾法并不能保證將各類微生物尤其是病毒完全去除，并且過(guò)濾法會(huì)延長(zhǎng)操作時(shí)間，不利于實(shí)際生產(chǎn)。因此，應(yīng)進(jìn)一步探索采取更加簡(jiǎn)便、有效的方法去除組織中的各類微生物。經(jīng)試驗(yàn)證明，此次制備的豬脾TF能夠顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增加E玫瑰花環(huán)形成數(shù)。說(shuō)明TF能夠增強(qiáng)動(dòng)物的非特異性免疫能力，并能夠增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的免疫活性。畜禽在接種疫苗后5～7 d才能產(chǎn)生有效的抗體，在這段時(shí)間內(nèi)機(jī)體的抗體水平低，抗病能力差，一旦有病原體感染則很容易發(fā)病，如果在這段免疫間隙期內(nèi)使用TF則能有效增強(qiáng)動(dòng)物的抗病能力。此外，初生動(dòng)物的免疫功能尚未健全，如果在初生動(dòng)物中使用成年動(dòng)物的TF，則能夠增強(qiáng)初生動(dòng)物的抗病能力，如崔恒宓等[11]通過(guò)試驗(yàn)證明，初生仔豬注射成年豬TF可將成年豬的免疫功能盡早轉(zhuǎn)移給仔豬，從而促進(jìn)仔豬的免疫功能發(fā)育。有報(bào)道指出，TF能夠增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞的活性，從而增加機(jī)體的體液免疫抗體滴度[12]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，在進(jìn)行豬瘟免疫時(shí)配合使用TF，可改善豬的免疫機(jī)能，顯著提高其抗體滴度，從而有效提高豬瘟疫苗的免疫效果，值得在生豬免疫中推廣使用。但是本試驗(yàn)中豬脾TF以1 mL/只的劑量進(jìn)行使用是否最佳，以及母源抗體水平高低對(duì)豬脾TF作用效果有無(wú)影響尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。通過(guò)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力和E玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)，雖能在一定程度上測(cè)定豬脾TF的免疫活性，但是這些試驗(yàn)結(jié)果的判定都存在一定的主觀性，且試驗(yàn)重復(fù)性受到不同批次試驗(yàn)動(dòng)物免疫狀態(tài)差別的影響，因此，建立適宜的動(dòng)物模型和簡(jiǎn)便有效的活性測(cè)定方法，將是今后研究的重點(diǎn)。

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2.2.5 E玫瑰花環(huán)試驗(yàn) 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理可知，加入豬脾TF的試驗(yàn)組中E玫瑰花環(huán)形成數(shù)和E玫瑰花環(huán)形成率較對(duì)照組均有明顯提高，差異極顯著（P<0.01）（表4）。

2.2.6 豬脾TF對(duì)體液免疫效果的影響 由表5可見(jiàn)，免疫前試驗(yàn)組與對(duì)照組的豬瘟抗體平均滴度（用以2為底的對(duì)數(shù)值表示，下同）均為4.45；免疫后21 d，對(duì)照組的抗體平均滴度測(cè)量值達(dá)到5.05，而試驗(yàn)組的抗體平均滴度測(cè)量值則達(dá)到6.35，免疫后分別上升了0.60和1.90，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，兩者差異顯著（P<0.05）。

3 小結(jié)與討論

將新鮮健康豬脾組織經(jīng)高速組織搗碎機(jī)高速勻漿多次，再經(jīng)反復(fù)凍融、離心、透析、過(guò)濾除菌，可制得豬脾TF，此法簡(jiǎn)便、成本低廉、不需要特殊的器材和設(shè)備。此外，由于TF在常溫下易失活，因此，相關(guān)操作（如離心、透析）應(yīng)在低溫下進(jìn)行。利用透析法制備的豬脾TF無(wú)毒性、無(wú)熱原、無(wú)抗原性，符合獸醫(yī)的臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)。但是在實(shí)際生產(chǎn)中，豬脾臟的來(lái)源廣泛，很難確保脾臟組織中不含細(xì)菌、病毒等微生物，而采用過(guò)濾法并不能保證將各類微生物尤其是病毒完全去除，并且過(guò)濾法會(huì)延長(zhǎng)操作時(shí)間，不利于實(shí)際生產(chǎn)。因此，應(yīng)進(jìn)一步探索采取更加簡(jiǎn)便、有效的方法去除組織中的各類微生物。經(jīng)試驗(yàn)證明，此次制備的豬脾TF能夠顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增加E玫瑰花環(huán)形成數(shù)。說(shuō)明TF能夠增強(qiáng)動(dòng)物的非特異性免疫能力，并能夠增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的免疫活性。畜禽在接種疫苗后5～7 d才能產(chǎn)生有效的抗體，在這段時(shí)間內(nèi)機(jī)體的抗體水平低，抗病能力差，一旦有病原體感染則很容易發(fā)病，如果在這段免疫間隙期內(nèi)使用TF則能有效增強(qiáng)動(dòng)物的抗病能力。此外，初生動(dòng)物的免疫功能尚未健全，如果在初生動(dòng)物中使用成年動(dòng)物的TF，則能夠增強(qiáng)初生動(dòng)物的抗病能力，如崔恒宓等[11]通過(guò)試驗(yàn)證明，初生仔豬注射成年豬TF可將成年豬的免疫功能盡早轉(zhuǎn)移給仔豬，從而促進(jìn)仔豬的免疫功能發(fā)育。有報(bào)道指出，TF能夠增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞的活性，從而增加機(jī)體的體液免疫抗體滴度[12]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，在進(jìn)行豬瘟免疫時(shí)配合使用TF，可改善豬的免疫機(jī)能，顯著提高其抗體滴度，從而有效提高豬瘟疫苗的免疫效果，值得在生豬免疫中推廣使用。但是本試驗(yàn)中豬脾TF以1 mL/只的劑量進(jìn)行使用是否最佳，以及母源抗體水平高低對(duì)豬脾TF作用效果有無(wú)影響尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。通過(guò)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力和E玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)，雖能在一定程度上測(cè)定豬脾TF的免疫活性，但是這些試驗(yàn)結(jié)果的判定都存在一定的主觀性，且試驗(yàn)重復(fù)性受到不同批次試驗(yàn)動(dòng)物免疫狀態(tài)差別的影響，因此，建立適宜的動(dòng)物模型和簡(jiǎn)便有效的活性測(cè)定方法，將是今后研究的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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[7] 藏廣田.應(yīng)用TF對(duì)人工感染雞新城疫和雞傳染性喉氣管炎治療試驗(yàn)初報(bào)[J].河南畜牧獸醫(yī)，1981（1）：12-13.

[8] 李學(xué)良，劉潤(rùn)珍，李炳云，等.動(dòng)物TF的研制與臨床應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，1995（10）：22-23.

[9] 郭寶福，郭 鑫，高 爽.TF對(duì)奶牛隱性乳房炎的療效觀察[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，1993（5）：21-22.

[10] 中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).中國(guó)生物制品規(guī)程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

[11] 崔恒宓，金韶華，毛九德，等.豬脾轉(zhuǎn)移因子的部分生化和免疫性及其應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1994，25（4）：317-322.

[12] 喬彥良.動(dòng)物轉(zhuǎn)移因子研究與在畜禽疫病防治中的應(yīng)用[J].中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)刊，2002，19（23）：45-47.

2.2.5 E玫瑰花環(huán)試驗(yàn) 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理可知，加入豬脾TF的試驗(yàn)組中E玫瑰花環(huán)形成數(shù)和E玫瑰花環(huán)形成率較對(duì)照組均有明顯提高，差異極顯著（P<0.01）（表4）。

2.2.6 豬脾TF對(duì)體液免疫效果的影響 由表5可見(jiàn)，免疫前試驗(yàn)組與對(duì)照組的豬瘟抗體平均滴度（用以2為底的對(duì)數(shù)值表示，下同）均為4.45；免疫后21 d，對(duì)照組的抗體平均滴度測(cè)量值達(dá)到5.05，而試驗(yàn)組的抗體平均滴度測(cè)量值則達(dá)到6.35，免疫后分別上升了0.60和1.90，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，兩者差異顯著（P<0.05）。

3 小結(jié)與討論

將新鮮健康豬脾組織經(jīng)高速組織搗碎機(jī)高速勻漿多次，再經(jīng)反復(fù)凍融、離心、透析、過(guò)濾除菌，可制得豬脾TF，此法簡(jiǎn)便、成本低廉、不需要特殊的器材和設(shè)備。此外，由于TF在常溫下易失活，因此，相關(guān)操作（如離心、透析）應(yīng)在低溫下進(jìn)行。利用透析法制備的豬脾TF無(wú)毒性、無(wú)熱原、無(wú)抗原性，符合獸醫(yī)的臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)。但是在實(shí)際生產(chǎn)中，豬脾臟的來(lái)源廣泛，很難確保脾臟組織中不含細(xì)菌、病毒等微生物，而采用過(guò)濾法并不能保證將各類微生物尤其是病毒完全去除，并且過(guò)濾法會(huì)延長(zhǎng)操作時(shí)間，不利于實(shí)際生產(chǎn)。因此，應(yīng)進(jìn)一步探索采取更加簡(jiǎn)便、有效的方法去除組織中的各類微生物。經(jīng)試驗(yàn)證明，此次制備的豬脾TF能夠顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增加E玫瑰花環(huán)形成數(shù)。說(shuō)明TF能夠增強(qiáng)動(dòng)物的非特異性免疫能力，并能夠增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的免疫活性。畜禽在接種疫苗后5～7 d才能產(chǎn)生有效的抗體，在這段時(shí)間內(nèi)機(jī)體的抗體水平低，抗病能力差，一旦有病原體感染則很容易發(fā)病，如果在這段免疫間隙期內(nèi)使用TF則能有效增強(qiáng)動(dòng)物的抗病能力。此外，初生動(dòng)物的免疫功能尚未健全，如果在初生動(dòng)物中使用成年動(dòng)物的TF，則能夠增強(qiáng)初生動(dòng)物的抗病能力，如崔恒宓等[11]通過(guò)試驗(yàn)證明，初生仔豬注射成年豬TF可將成年豬的免疫功能盡早轉(zhuǎn)移給仔豬，從而促進(jìn)仔豬的免疫功能發(fā)育。有報(bào)道指出，TF能夠增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞的活性，從而增加機(jī)體的體液免疫抗體滴度[12]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，在進(jìn)行豬瘟免疫時(shí)配合使用TF，可改善豬的免疫機(jī)能，顯著提高其抗體滴度，從而有效提高豬瘟疫苗的免疫效果，值得在生豬免疫中推廣使用。但是本試驗(yàn)中豬脾TF以1 mL/只的劑量進(jìn)行使用是否最佳，以及母源抗體水平高低對(duì)豬脾TF作用效果有無(wú)影響尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。通過(guò)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力和E玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)，雖能在一定程度上測(cè)定豬脾TF的免疫活性，但是這些試驗(yàn)結(jié)果的判定都存在一定的主觀性，且試驗(yàn)重復(fù)性受到不同批次試驗(yàn)動(dòng)物免疫狀態(tài)差別的影響，因此，建立適宜的動(dòng)物模型和簡(jiǎn)便有效的活性測(cè)定方法，將是今后研究的重點(diǎn)。

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[4] PETERSEN E A，GREENBERG L E，MANZARA T，et al. Murine transfer factor. I. Description of the model and evidence for specificity[J].J Immunol，1981，126（6）：2480-2484.

[5] KIRKPATRICK C H， ROZZO S J， MASCALI J J， et al. Murine transfer factor.Ⅱ.Transfer of delayed hypersensitivity to synthetic antigens [J].J Immunol，1985，134（3）：1723-1727.

[6] 蔡琳昌.豬脾轉(zhuǎn)移因子的制備及質(zhì)量控制[A].第四屆全國(guó)轉(zhuǎn)移因子學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C].北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1990.158-161.

[7] 藏廣田.應(yīng)用TF對(duì)人工感染雞新城疫和雞傳染性喉氣管炎治療試驗(yàn)初報(bào)[J].河南畜牧獸醫(yī)，1981（1）：12-13.

[8] 李學(xué)良，劉潤(rùn)珍，李炳云，等.動(dòng)物TF的研制與臨床應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，1995（10）：22-23.

[9] 郭寶福，郭 鑫，高 爽.TF對(duì)奶牛隱性乳房炎的療效觀察[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，1993（5）：21-22.

[10] 中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).中國(guó)生物制品規(guī)程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

[11] 崔恒宓，金韶華，毛九德，等.豬脾轉(zhuǎn)移因子的部分生化和免疫性及其應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1994，25（4）：317-322.

[12] 喬彥良.動(dòng)物轉(zhuǎn)移因子研究與在畜禽疫病防治中的應(yīng)用[J].中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)刊，2002，19（23）：45-47.