李繼峰　王娜

[摘要] 目的 探討腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Val66Met多態(tài)性與腦出血的關(guān)系。 方法 采用限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)檢測(cè)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Val66Met多態(tài)性，在110例腦出血患者和101名健康對(duì)照組中的分布；比較病例組、對(duì)照組基因型、等位基因分布差異。 結(jié)果 （1）腦出血組和對(duì)照組A基因型分布頻率分別為0.40和0.20，顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=13.81，P=0.001）； （2）兩組等位基因分布頻率差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2 =13.12，P=0.000）。 結(jié)論 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Val66Met多態(tài)性的A等位基因同腦出血相關(guān)，可能該病的易感基因。

[關(guān)鍵詞] 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；Val66Met；多態(tài)性；腦出血

[中圖分類號(hào)] R741 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）04-62-03

Positive association of brain-derived neurotrophic factor（BDNF） gene Val66Met polymorphism with cerebral hemorrhage

LI Jifeng1 WANG Na2

1.Department of Neurology，Dengfeng People's Hospital， Dengfeng 452470，China；2.Department of Psychiatry，Zhengzhou Ninth People's Hospital，Zhengzhou 450053，China

[Abstract] Objective To explore the possible association between Val66Met polymorphism of BDNF and cerebral hemorrhage in Chinese Han population. Methods We analyzed polymorphisms of the BDNF Val66Met polymorphism with a lfragmentation length polymorphism（RFLP）-based method in 110 patients with cerebral hemorrhage and 101 unrelated healthy control subjects. Results （1）The AA genotypes frequencies of Val66Met polymorphism in cerebral hemorrhage patients and control subjects were 0.40 and 0.20，respectively，the difference was statistic（x2=13.81，P=0.001） （2）The allele frequencies of Val66Met polymorphism in cerebral hemorrhage and control group were significant（x2=13.12，P=0.000）.And the allele A frequency of Val66Met in cerebral hemorrhage patients was significantly higher than that of control subjects （P<0.01）. Conclusion This study suggests that the BDNF Val66Met may be the major risk factors in increasing susceptibility to cerebral hemorrhage in Chinese Han population.

[Key words] Brain-derived neurotrophic factor（BDNF） gene；Val66Met；Polymorphism；Cerebral hemorrhage

既往的研究表明，腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）后，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)顯著增高，但是其機(jī)制尚不完全明了[1-2]。在BDNF基因眾多的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中，位于第五外顯子區(qū)域的Val66Met多態(tài)性同調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)密切相關(guān)，但該基因是否同腦出血相關(guān)，目前的報(bào)告較少，因此本研究擬采用病例-對(duì)照法探討腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因Val66Met的多態(tài)性同腦出血的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

腦出血組：來(lái)源于2010年2月～2013年5月期間符合急性ICH入選標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)腦出血家族史患者110例，其中男62例，女48例，48～76歲，平均（53.4±12.1）歲，全部病例經(jīng)臨床和頭部CT或MRI證實(shí)，均符合全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)腦出血家族史。

對(duì)照組：為同期來(lái)醫(yī)院門診體檢的健康人群101例，其中男58例，女43例，47～65歲，平均（51.4±13.2）歲，無(wú)腦出血家族史。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 所有研究對(duì)象在完成臨床資料采集后，于清晨空腹抽取肘前靜脈血5mL，EDTA抗凝，DNA提取試劑盒為TIANGEN公司的AxyPrep-96全血基因組DNA試劑盒，按照說明書進(jìn)行DNA抽取，提取的DNA凍存于-70℃冰箱待測(cè)。

1.2.2 Val66Met多態(tài)性的檢測(cè) 限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)檢測(cè)BDNF Val66Met 的多態(tài)性，正向引物序列為：5，-TTTCTCCCTACAGTTCCACCAG-3，反向引物序列為：5，-CTCCAAAGGCACTTGACTACTG-3。PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min，95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，2%瓊脂糖凝膠電泳分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0 for windows軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用x2檢驗(yàn)，分別比較病例組，對(duì)照組基因型、等位基因分布差異，并與腦出血患者進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。使用Hardy-Weinderg Diagnostics Version 2.0軟件分析基因型、等位基因頻率是否符合Hardy-Weinderg平衡定律；顯著性水平為P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BDNF基因Val66Met的多態(tài)性基因型判斷

PmII酶切后等位基因的片段：當(dāng)序列為A（Met）等位基因時(shí)，其長(zhǎng)度為300bp，當(dāng)序列為G（Val）等位基因時(shí)，其長(zhǎng)度為180bp和120bp，通過瓊脂糖凝膠電泳來(lái)確定個(gè)體的基因型。

2.2 SNPs位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

采用Hardy-Weinberg遺傳平衡（H-W平衡）檢驗(yàn)，對(duì)Val66Met的SNPs基因型和等位基因進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其符合H-W平衡定律（P>0.05）。

2.3 Val66Met位點(diǎn)基因型頻率和等位基因在組間分布頻率的比較

病例組和對(duì)照組的Val66Met位點(diǎn)的基因型和等位基因頻度見表1，比較發(fā)現(xiàn)其基因型分布頻率和等位基因頻率組間存在明顯差異（P<0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果顯示河南鄭州地區(qū)漢族人群中腦出血患者組和對(duì)照組BDNF基因Val66Met多態(tài)AA基因型頻率分別為0.40和0.20，差異具有顯著性（x2=13.81，P=0.001），且腦出血患者組A等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，差異具有顯著性（x2=13.12，P=0.000），推測(cè)Val66Met多態(tài)A等位基因可能是腦出血患者的易感基因。

BDNF基崗位于人染色體11p13上，包含11個(gè)外顯子，全長(zhǎng)70kb，其中Val66Met位于BDNF基因第11外顯子編碼區(qū)，該位點(diǎn)的核苷酸改變使得BDNF前體蛋向第66號(hào)氨基酸由纈氨酸改變?yōu)榈鞍彼?，是一錯(cuò)義突變，該錯(cuò)義突變可能影響B(tài)DNF的蛋白結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而可能是腦出血患者的易感基因[3-4]。既往的研究表明，A等位基因可能影響到BDNF基因相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，影響B(tài)DNF的功能，進(jìn)而可能是腦出血的危險(xiǎn)因素[5-7]。腦出血后，除誘導(dǎo)損傷區(qū)域的細(xì)胞分泌多種致神經(jīng)元損傷的細(xì)胞因子外，也激活了神經(jīng)元的自我保護(hù)機(jī)制。國(guó)內(nèi)外的研究已經(jīng)表明，在腦出血患者，BDNF可為損傷神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)而促進(jìn)其存活與修復(fù)，其血液和腦脊液中BDNF的含量明顯增加，從而達(dá)到保護(hù)腦出血患者的神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元再生和功能修復(fù)的作用[8-10]。

因此，我們推測(cè)BDNF基因Val66Met多態(tài)性改變了BDNF基因相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，影響了腦出血后BDNF的分泌，而BDNF通過促進(jìn)血腫周圍神經(jīng)元以自分泌和旁分泌方式作用于自身或鄰近神經(jīng)元，以保護(hù)受損神經(jīng)元免遭變性壞死，從而最大限度的保護(hù)受損神經(jīng)元。因此本研究提示，在今后的研究中，通過藥物和其他措施提高BDNF的表達(dá)水平，延長(zhǎng)其表達(dá)時(shí)間，對(duì)于保護(hù)受損神經(jīng)元，顯得尤為必要。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Han QQ，Jin W，Xiao ZF，et al.The promotion of neurological recovery in an intracerebral hemorrhage model using fibrin-binding brain derived neurotrophic factor[J].Biomaterials，2011，32（12）：3244-3252.

[2] Erickson KI，Banducci SE，Weinstein AM，et al.The brain-derived neurotrophic factor Val66Met polymorphism moderates an effect of physical activity on working memory performance[J].Psychol Sci，2013，24（9）：1770-1779.

（下轉(zhuǎn)第頁(yè)）

（上接第頁(yè)）

[3] Suriyaprom K，Tungtrongchitr R，Thawnashom K，et al.BDNF Val66Met polymorphism and serum concentrations of BDNF with smoking in Thai males[J].Genet Mol Res，2013，12（4）：4925-4933.

[4] Kang JI， Kim SJ， Song YY，et al.Genetic Influence of COMT and BDNF Gene Polymorphisms on Resilience in Healthy College Students[J].Neuropsychobiology，2013，68（3）：174-180.

[5] 周政，陳惠孫，張可成，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子和中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2003，7（10）：1554-1555.

[6] Nonner D，Brass BJ，Barrett EF，et al.Reversibility of nerve growth factor's enhancement of choline acetyltransferase activity in cultured embryonic rat septum[J].Exp Neurol，1993，122（2）：196-208.

[7] 秦桂霞.BONF對(duì)大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].黑龍江醫(yī)藥，2006，19（1）：47-48.

[8] Kim DH，Zhao X，Tu CH，et al.Prevention of apoptotic but not necrotic cell death following neuronal injury by neurotrophins signaling through the tyrosine kinase receptor[J].J Neurosurg，2004，100（1）：79-87.

[9] 陳勝利，龔濤，李長(zhǎng)清，等.高血壓腦出血患者腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平變化及其與神經(jīng)功能的相關(guān)性研究[J].中華全科醫(yī)師雜志，2011，10（11）：821-823.

[10] 武衡.腦出血大鼠腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白及mRNA表達(dá)變化與意義[J].中華老年心腦血管病雜志，2006，8（8）：564-567.

（收稿日期：2013-12-17）