秦豪榮++董飚++孫國波等

摘要：采用PCR-SSCP技術(shù)對黑羽番鴨A-FABP基因內(nèi)含子進(jìn)行多態(tài)性檢測，分析多態(tài)性與早期體質(zhì)量、屠宰性能、常規(guī)肉品質(zhì)、肌肉營養(yǎng)成分等指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果表明：黑羽番鴨A-FABP基因第1內(nèi)含子存在G921C單核苷酸突變，形成了HH、HI、II 3種基因型，H等位基因頻率為0.129 6，I等位基因頻率為0.870 4，群體純合度為0.774 3，多態(tài)信息含量為0.200 2；除2周齡公鴨II型體質(zhì)量顯著高于HI型外，同性別黑羽番鴨早期體質(zhì)量在不同基因型之間并無顯著差異；公鴨、母鴨均表現(xiàn)為II基因型腹脂質(zhì)量、腹脂率顯著高于HI基因型，公鴨HI型肝質(zhì)量、腺肌胃質(zhì)量顯著高于II型，其他屠宰性能指標(biāo)在同性別黑羽番鴨不同基因型之間無顯著差異；同性別黑羽番鴨II型胸肌中肌苷酸含量顯著高于HI型，膽固醇含量在不同基因型間無顯著差異；腿肌中同性別不同基因型間膽固醇、肌苷酸含量差異不顯著。綜合分析可知，A-FABP基因內(nèi)含子1中921位的G-C突變會影響黑羽番鴨脂肪沉積能力、胸肌肌苷酸含量。

關(guān)鍵詞：黑羽番鴨；A-FABP基因；多態(tài)性；生產(chǎn)性能

中圖分類號： S834.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0030-04

收稿日期：2015-03-31

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（14）2072]；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程（編號：SXGC[2014]272）。

作者簡介：秦豪榮（1966—），男，山西稷山人，碩士，教授，主要從事水禽品種保護(hù)、開發(fā)和利用工作。E-mail：391248766@qq.com。目前，我國大部分地區(qū)所飼養(yǎng)的肉用型鴨主要是櫻桃谷鴨、北京鴨、番鴨等，均表現(xiàn)為生長速度快、飼料報(bào)酬高等特點(diǎn)，可以滿足多層次消費(fèi)者的需求。其中番鴨原產(chǎn)于美洲中南部的熱帶地區(qū)，是棲鴨屬鴨種，與其他類型肉鴨不同屬。番鴨根據(jù)羽毛顏色分為白色、黑色、花色3種，其中白羽番鴨體型較大，花羽番鴨體型居中，黑羽番鴨體型較小。番鴨產(chǎn)肉獨(dú)特，具野禽風(fēng)味特點(diǎn)，胴體脂肪含量低，但在番鴨產(chǎn)品加工和烹飪中，適當(dāng)?shù)闹境练e有利于增加鴨肉的風(fēng)味和品質(zhì)。禽類脂肪沉積是由遺傳、營養(yǎng)、飼養(yǎng)環(huán)境等因素決定的，其中遺傳是最基本的因素[1]。在遺傳因素中，與脂肪沉積相關(guān)的功能基因較多，如過氧化物酶體增殖劑激活受體、脂聯(lián)素基因、脂肪酸結(jié)合蛋白等，它們在脂肪沉積過程中起著重要作用，但是每個(gè)功能基因的作用又是微效的。

脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP）是一類細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，可以與脂肪酸結(jié)合將其運(yùn)輸?shù)街舅嵫趸⒏视腿ゼ傲字暮铣晌恢?，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪合成[2]。FABPs類型較多，其命名是根據(jù)分離出的第1種組織來確定的，目前至少有11種，脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（A-FABP）基因就是首先在脂肪組織中被發(fā)現(xiàn)、在脂肪組織中高度表達(dá)的。櫻桃谷鴨內(nèi)含子2中的4個(gè)單核苷酸突變會顯著影響腹脂質(zhì)量、腹脂率、皮脂率和腿肌脂肪含量等指標(biāo)，推測A-FABP基因與鴨脂肪代謝有著密切的關(guān)系[3]。A-FABP基因內(nèi)含子1中T1074G、A1089C突變形成的基因型之間胸肌率、肌肉pH值以及胸肌肌內(nèi)脂肪含量有顯著性差異[4]。A-FABP含量與雞肌內(nèi)脂肪（IMP）含量有著密切的關(guān)系，A-FABP基因被作為肌苷酸（IMF）含量的候選基因，可影響肌肉的肉質(zhì)[5-6]。禽類A-FABP基因與脂肪沉積、肌肉品質(zhì)等方面的研究已經(jīng)起步，但是其影響程度如何還需繼續(xù)開展此方面的工作。本研究運(yùn)用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）原理檢測黑羽番鴨A-FABP基因多態(tài)性，測定早期體質(zhì)量、13周齡屠宰性能、常規(guī)肉品質(zhì)和肌肉中營養(yǎng)成分等指標(biāo)，分析A-FABP基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)性，以期為鴨A-FABP基因功能研究提供資料。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動物

選擇健康、同日齡出雛的黑羽番鴨公鴨96羽、母鴨66羽，分別佩戴翅號，混群飼養(yǎng)。0～3周齡封閉式舍飼育雛，所用飼料代謝能12.0 MJ/kg，粗蛋白質(zhì)含量20.0%。4～13周齡半封閉式飼養(yǎng)，其中4～7周齡飼料代謝能11.5 MJ/kg，粗蛋白質(zhì)含量16.5%；8～13周齡飼料代謝能11.0 MJ/kg，粗蛋白質(zhì)含量16.0%。

1.2數(shù)據(jù)采集

1.2.1產(chǎn)肉性能測定測定黑羽番鴨初生、2、4、6、8、10、13周齡時(shí)體質(zhì)量，測定13周齡時(shí)宰前活質(zhì)量、屠體質(zhì)量、半凈膛質(zhì)量、全凈膛質(zhì)量、腿肌質(zhì)量、胸肌質(zhì)量、肝質(zhì)量、心質(zhì)量、腺肌胃質(zhì)量、腹脂質(zhì)量等屠宰指標(biāo)，各指標(biāo)測定方法及其比例計(jì)算公式參考NY/T 823—2004《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計(jì)方法》。

1.2.2肉質(zhì)性能測定在13周齡時(shí)，測定胸肌和腿肌的失水率、剪切力（嫩度）及pH值等常規(guī)肉質(zhì)性狀，測定方法參考NY/T823-2004《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計(jì)方法》。肌肉中膽固醇的含量采用氣相色譜儀測定。肌苷酸含量采用索氏浸提法提取，用儀器進(jìn)行HPLC分析。

1.3引物設(shè)計(jì)

根據(jù)A-FABP基因序列在第1、2內(nèi)含子上分別設(shè)計(jì)了1對引物，用于多態(tài)性檢測（表1）。表1引物基本信息

1.4試驗(yàn)步驟

1.4.1鴨基因組DNA的制備在13周齡時(shí)，每羽鴨翅靜脈采血1mL，肝素鈉抗凝，離心留取紅細(xì)胞。血液紅細(xì)胞在55 ℃下經(jīng)過裂解液、SDS、蛋白酶K的混合液過夜消化，用常規(guī)酚/三氯甲烷法抽提和乙醇沉淀法獲取基因組DNA，待乙醇揮發(fā)后加水溶解，測定DNA質(zhì)量后將其濃度調(diào)整為50～100 ng/μL備用。

1.4.2PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為20 μL，各組分濃度為：1×buffer（含1.5 mmol/L Mg2+ ）、0.8 mmol/L dNTPs、上下游引物各0.4 pmol/L、0.04 U/μL Taq酶、4 ng/μL DNA模板，用蒸餾水調(diào)整確保各成分濃度。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，溫度降低至室溫。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，成像條帶清晰，與預(yù)期片段大小一致，可用于SSCP檢測。

1.4.3SSCP分析及測序5 μL PCR 產(chǎn)物和4 μL加樣緩沖液混勻（主要成分為去離子甲酰胺），98 ℃變性10 min，然后冰水浴5 min，變性后PCR產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳過夜，電壓根據(jù)條帶位置進(jìn)行調(diào)整，銀染顯色，進(jìn)行基因型判別。

對每種純合子基因型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠純化回收，通過克隆、測序等流程獲得不同基因型的DNA序列，通過比對獲知基因型之間核苷酸序列發(fā)生位置。

1.5數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用公式計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、純合度、雜合度和多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)，運(yùn)用SPSS13.0軟件中的單因素方差分析法比較不同基因型間生產(chǎn)性能的差異程度。

2結(jié)果與分析

2.1基因型識別和序列比較

所設(shè)計(jì)的2對引物均可擴(kuò)增出產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)條帶單一，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，引物P1存在多態(tài)性。黑羽番鴨部分樣品引物P1檢測結(jié)果見圖1，可以看出形成了3種基因型，分別命名為HH、HI、II。通過測序獲得HH、II純合子的序列，比對發(fā)現(xiàn)2個(gè)序列之間只有1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了堿基突變，為第1內(nèi)含子第921處的G-C突變（圖2）。

2.2群體遺傳信息統(tǒng)計(jì)

在所測群體中HH型頻率為0.018 5，HI型頻率為0.222 2，II型頻率為0.759 3，H等位基因頻率為0.129 6，I等位基因頻率為0.870 4，群體純合度為0.774 3，雜合度為0.225 7，多態(tài)信息含量為0.200 2。

2.3不同基因型間體質(zhì)量比較結(jié)果

由于公鴨、母鴨HH基因型數(shù)量小于3個(gè)，故沒有參與基因型和生產(chǎn)性能相關(guān)性分析。由表2可知，除2周齡公鴨II型體質(zhì)量顯著高于HI型外，其他測定點(diǎn)公鴨不同基因型間無顯著性差異；各個(gè)測定點(diǎn)母鴨不同基因型間體質(zhì)量均無顯著差異。

2.4不同基因型間屠宰性能比較結(jié)果

由表3可知，HI型公鴨肝質(zhì)量、腺肌胃質(zhì)量顯著高于II型公鴨，II型公鴨腹脂質(zhì)量、腹脂率顯著性高于HI型公鴨，其他指標(biāo)在公鴨不同基因型之間無顯著性差異。II型母鴨腹脂質(zhì)量、腹脂率顯著性高于HI型母鴨，其他指標(biāo)在母鴨不同基因型之間無顯著性差異。

2.5不同基因型間常規(guī)肉品質(zhì)比較結(jié)果

由表4可知，HI型公鴨腿肌pH值顯著高于II型公鴨，其他指標(biāo)在公鴨（或母鴨）不同基因型之間無顯著性差異。

2.6不同基因型間肌肉營養(yǎng)成分比較結(jié)果

由表5可知，II型黑羽番鴨胸肌中肌苷酸含量顯著高于同性別HI型，膽固醇在公鴨胸肌中無顯著差異；腿肌中同性別不同基因型間膽固醇、肌苷酸含量差異不顯著。

3結(jié)論與討論

在真核生物基因組序列中，只有少數(shù)序列在基因轉(zhuǎn)錄過程中通過一系列過程得以拼接形成能夠翻譯蛋白質(zhì)的編碼區(qū)表5不同基因型間肌肉營養(yǎng)成分含量比較

性別基因型樣本量

（羽）胸肌腿肌膽固醇含量（mg/g）肌苷酸含量（mg/g）膽固醇含量（mg/g ）肌苷酸含量（mg/g）公鴨HI950.18±9.70b2.71±0.32b48.75±6.23a2.56±0.45bII3357.53±9.72ab3.44±0.57a53.98±8.55a2.88±0.78ab母鴨HI1251.82±10.81ab2.46±0.55b49.27±6.97a3.03±0.54abII3058.48±10.86a3.26±0.42a55.09±9.51a3.36±0.54a

序列，而絕大部分序列作為非編碼區(qū)序列被切除。研究者發(fā)現(xiàn)，基因組中非編碼序列的比例與生物的復(fù)雜度成正比[7]。內(nèi)含子就是非編碼區(qū)序列之一，雖然不能直接編碼蛋白質(zhì)，但是在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中對基因的表達(dá)具有調(diào)控作用，還可增強(qiáng)生物對基因突變耐受力，提高物種生存能力[8]。內(nèi)含子潛在的作用備受廣大研究者的青睞，相關(guān)研究已經(jīng)開展。本試驗(yàn)在A-FABP基因內(nèi)含子1、2上各設(shè)計(jì)了1對引物，采用PCR-SSCP方法檢測了黑羽番鴨A-FABP基因存在的單核苷酸多態(tài)，結(jié)果在第1內(nèi)含子第921處發(fā)現(xiàn)了G-C突變，形成了HH、HI、II 3種基因型，其中HH基因型含量較低，II基因型含量較高，I等位基因頻率是H型的7倍，占據(jù)明顯優(yōu)勢，其原因可能是在黑羽番鴨培育過程中由于生產(chǎn)性能方面指標(biāo)的選育使I等位基因頻率被間接地提高了。遺傳參數(shù)分析顯示，群體純合度為0.774 3，雜合度為0.225 7，多態(tài)信息含量為0.200 2，群體雜合度和多態(tài)信息含量數(shù)據(jù)反映了黑羽番鴨該位點(diǎn)呈現(xiàn)低度多態(tài)，此位點(diǎn)的變異程度小，可進(jìn)行選擇的空間窄。通過常規(guī)的育種方法間接提高II型的比例難度很大，但是用分子標(biāo)記技術(shù)可以檢測每羽鴨的基因型，根據(jù)需要選擇公、母鴨進(jìn)行配種得到理想的基因型個(gè)體。

動物A-FABP可以作為體內(nèi)甘油三酯的貯存庫，通過儲存或釋放出大量的脂肪酸來調(diào)控甘油三酯的形成和脂解，從而參與脂生產(chǎn)及脂解的生化循環(huán)[9-10] 。羅桂芬等報(bào)道A-FABP基因突變對雞脂肪沉積有顯著影響[11]。Wang等研究發(fā)現(xiàn) A-FABP 多態(tài)性與體質(zhì)量、腹脂率的關(guān)系，表明 A-FABP基因的變異與腹脂率顯著相關(guān)[12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，黑羽番鴨早期體質(zhì)量在不同基因型之間并無顯著差異；在屠宰性能方面，公鴨和母鴨均表現(xiàn)為II基因型腹脂質(zhì)量、腹脂率顯著高于HI基因型，公鴨HI型肝質(zhì)量、腺肌胃質(zhì)量顯著高于II型，其他屠宰性能指標(biāo)在同性別不同基因型之間無顯著差異，揭示了A-FABP基因該位點(diǎn)多態(tài)性與黑羽番鴨脂肪沉積能力有著密切的關(guān)系。

肌肉品質(zhì)分析包括了常規(guī)肉品質(zhì)和肌肉中營養(yǎng)成分分析。本試驗(yàn)常規(guī)肉品質(zhì)測定了胸肌、腿肌的pH值、剪切力、失水率 3個(gè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)只有公鴨腿肌pH值在不同基因型之間存在顯著差異，其他指標(biāo)在同性別不同基因型之間均無顯著差異。肌苷酸是肉質(zhì)鮮味的重要成分，是衡量肉質(zhì)鮮味的一項(xiàng)重要指標(biāo)[13]。在動物被屠宰后，肌肉中ATP酶活化分解ATP成為ADP，ADP在多種酶的作用下生產(chǎn)肌苷酸，并進(jìn)一步水解產(chǎn)生次黃嘌呤和核糖。肌肉中次黃嘌呤核苷酸及其他分解產(chǎn)物的積累可增加肉的鮮味[14]。膽固醇是人體維持正常生理活動的必需物質(zhì)，但是過量攝入膽固醇會使血液中膽固醇含量升高，引起心腦血管疾病。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，II型黑羽番鴨胸肌中肌苷酸含量顯著高于同性別HI型，公鴨胸肌中膽固醇含量在不同基因型之間無顯著差異；腿肌中同性別不同基因型間膽固醇、肌苷酸含量差異不顯著，說明A-FABP基因內(nèi)含子1存在多態(tài)性對胸肌中膽固醇、肌苷酸含量有顯著影響。

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