張曉明，胡 俊，彭仕明，陳 武＊

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣州動物園，廣東 廣州 510070）

皰疹病毒Ⅰ型屬于皰疹病毒科中的α皰疹病毒，可引起貓科動物的急性、高度接觸性的上呼吸道感染，發(fā)病率可高達100%[1]。雖然成年貓科動物感染后大多痊愈，病死率很低，但幼仔感染后癥狀嚴重，病死率可達50%，甚至終生帶毒排毒，并可垂直傳播，危害很大[2]。該病毒于1958年由Crande R A和Maurer首次從美國患呼吸道疾病的仔貓體中分離鑒定[3]，隨后在歐亞等一些國家也相繼報道檢測到病毒。2012年4月和6月江蘇省蘇州動物園和廣東某養(yǎng)殖場以流鼻涕、咳嗽和支氣管充血和出血為主要癥狀的東北虎和華南虎出現(xiàn)流鼻涕、咳嗽和支氣管充血和出血等臨床癥狀，肖建雄等[4]研究證明了患虎感染的病毒是傳染性鼻氣管炎病毒，該病毒與貓皰疹病毒Ⅰ型基本一致。

預(yù)防虎源傳染性鼻氣管炎主要以注射疫苗免疫為主，但注射貓傳染性鼻氣管炎疫苗的保護作用甚微，國外動物園也報導(dǎo)類似情況[5]。因此，應(yīng)研制針對虎源傳染性鼻氣管炎的疫苗來預(yù)防虎源傳染性鼻氣管炎，其中研制DNA基因工程疫苗是現(xiàn)時比較快速與良好的方法。貓皰疹病毒Ⅰ型基因組編碼多種蛋白質(zhì)，其中g(shù)D糖蛋白具有高度的保守性和抗原性，gD蛋白能與細胞表面分子發(fā)生特異性結(jié)合，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，是病毒感染特異性宿主的主要作用蛋白[6]。本研究對皰疹病毒Ⅰ型的gD基因進行了擴增、克隆及構(gòu)建真核表達載體，為進一步研究虎皰疹病毒Ⅰ型的基因工程DNA疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、菌株和載體 293T細胞、pcDNA 3.1（＋）表達載體和DH5α大腸埃希菌均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院保存。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶Hin dⅢ和XhoⅠ、DreamTaqTMPCR Master Mix、轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；病毒DNA提取試劑盒（viral DNA extraction kit）DNA膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit）和質(zhì)粒小提試劑盒（Endo－Free Plasmid Mini KitⅡ），Omega公司產(chǎn)品；RNA抽提試劑（Trizol），Invitrogen公司產(chǎn)品；pMD18－T Simple克隆載體、T4DNA 連接酶、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptⅡI 1st Strand cDNA Synthesis Kit），TaKaRa公司產(chǎn)品；抗his標簽一抗 ，Bioworld公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)GenBank已公布的貓傳染性鼻氣管炎病毒基因組序列（序列號FJ478159）設(shè)計了擴增gD基因的一對引物，為方便檢測，在上游引物引入his標簽，同時在上、下游引物分別引入了HindⅢ和XhoⅠ酶切位點（下劃線部分）。引物序列如下：上游：5′－CCCAAGCTTCACCATCATCACCATCATATGAGAC－3′；下游：5′－CCGCTCG AGTTATAGATGGTGAG －3′；引 物 由Invitrogen公司合成。

1.2.2 病毒DNA的提取及目的基因克隆 病毒液從－80℃超低溫冰箱取出解凍后，使用Viral DNA extraction kit試劑盒進行DNA抽提，然后采用PCR擴增gD基因。PCR擴增體系為：在50μL PCR反應(yīng)體系中加入PCR mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA 2μL，ddH2O 19μL。擴增程序為：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃2min，35個循環(huán)；最后72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 目的片段的膠回收及其克隆載體構(gòu)建PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，使用DNA膠回收試劑盒進行目的基因片段膠回收純化，與PMD18T－simple克隆載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌，將轉(zhuǎn)化好的DH5α大腸埃希菌涂在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)過夜，然后挑取陽性菌落經(jīng)PCR鑒定后，提取重組質(zhì)粒，命名為18T－gD。

1.2.4 重組真核表達載體的構(gòu)建及其鑒定 抽提重組克隆載體18T－gD，用HindⅢ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶對18T－gD和表達載體pcDNA 3.1（＋）進行雙酶切，電泳后進行膠回收純化，用T4DNA連接酶將其定連接目的基因和表達載體，然后進行轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒，得到重組真核表達質(zhì)粒pcDNA－gD。利用Hin dⅢ和XhoⅠ對pcDNA－gD重組質(zhì)粒進行雙酶切和經(jīng)10g／L濃度瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定篩選出陽性重組質(zhì)粒pcDNA－gD并送英濰捷基生物技術(shù)公司測序鑒定。

1.2.5 重組真核表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞 培養(yǎng)293T細胞，當(dāng)細胞覆蓋率達到70%～90%時，參考轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent說明用TurboFect Transfection Reagent轉(zhuǎn) 染 pcDNA－gD重組質(zhì)粒，并設(shè)立空載體轉(zhuǎn)染的對照組。將轉(zhuǎn)染細胞置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h。

1.2.6 重組真核表達質(zhì)粒在293T細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達檢測 使用Trizol法抽提轉(zhuǎn)染48h的293T細胞mRNA，以此為模板進行RT－PCR反應(yīng)，檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄。同時收集轉(zhuǎn)染48h的293T細胞，加入100μL的1×SDS上樣緩沖液，充分混合后，100℃水浴5min，然后進行Western blot檢測。先將進行SDS－PAGE，將PAGE膠上蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含有50g／L脫脂奶粉的TBST溶液4℃條件封閉過夜，TBST沖洗3次后，與鼠抗HIS標簽單克隆抗體在室溫環(huán)境下作用1h，TBST洗滌3次，然后加入HRP標記羊抗鼠IgG二抗，室溫輕搖孵育2h，TBST洗滌3次，最終經(jīng)過DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 虎源傳染性鼻氣管炎病毒gD基因PCR擴增結(jié)果

以提取的虎源傳染性鼻氣管炎病毒DNA為模板，經(jīng)過PCR擴增后，得到的是約1143bp目的基因片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。

2.2 18T－gD的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

重組克隆載體18T－gD經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切電泳鑒定后，得到18T－2692bp的PMD－18Tsimple載體片段和1143bp的目的片段兩條DNA片段（圖2）。

圖1 FHV－1gD基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplifications of gD gene of FHV－1

2.3 18T－gD的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

重組克隆載體18T－gD經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切電泳鑒定后，得到18T－2692bp的PMD－18Tsimple載體片段和1143bp的目的片段兩條DNA片段（圖2）。

圖2 重組克隆載體雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid 18T－gD by enzymatic digestion

2.4 重組真核表達載體pcDNA－gD的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

重組克隆載體pcDNA－gD經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后，得到5428bp的載體片段和1143bp的目的片段（圖3）。

2.5 重組真核表達載體在293T細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達檢測

使用Trizol法分別抽取轉(zhuǎn)染pcDNA－gD和空載體48h的293T細胞的RNA后進行RT－PCR，轉(zhuǎn)染pcDNA－gD的得到1143bp的片段，而轉(zhuǎn)染空載體對照的沒有出現(xiàn)任何DNA片段。表明重組質(zhì)粒在293T細胞中得以成功轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)錄（圖4）。對轉(zhuǎn)染pcDNA－gD和空載體的293T細胞裂解物進行SDSPAGE后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。使用抗His標簽單克隆抗體作為一抗進行Western blot檢測，結(jié)果顯示表達的蛋白可被抗His標簽單克隆抗體識別，條帶大小約42.29ku，與預(yù)期大小一致（圖5）。

圖3 pcDNA－gD載體的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pcDNA－gD by enzymatic digestion

圖4 轉(zhuǎn)染293T細胞gD基因RT－PCR結(jié)果Fig.4 RT－PCR amplification of gD gene from 293Tcells after transfection

圖5 293T細胞表達的gD蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig.5 Western blot detection of gD protein expression in 293Tcells

3 討論

傳染性鼻氣管炎是貓科動物常見的傳染性病毒性疾病，該病目前并沒有特異性治療方法，主要以注射疫苗預(yù)防為主，針對貓已經(jīng)有商品化的疫苗，但這些針對貓的商品化疫苗據(jù)虎飼養(yǎng)相關(guān)人員反饋，對虎效果不明顯。因此，快速研制出適合虎使用的傳染性鼻氣管炎疫苗是非常有必要的。本研究以虎源傳染性鼻氣管炎病毒為模板，通過PCR擴增其gD基因片段，將其構(gòu)建到pcDNA3.1（＋）表達載體上，經(jīng)RT－PCR和Western blot檢測證實gD基因?qū)崿F(xiàn)正常轉(zhuǎn)錄和表達。

基因疫苗的研制成功與否，與選取的外源基因的免疫源性強弱有著密切關(guān)系?；⒃窗捳畈《劲裥褪蔷哂心夷さ碾p股DNA病毒，與貓皰疹病毒Ⅰ型在基因上高度相似，病毒囊膜糖蛋白對于病毒侵入宿主細胞并產(chǎn)生病理變化具有極其重要的作用，其作用分別有侵入、吸附和細胞間擴散等[7]。在研制基因疫苗時，通過選取擁有良好免疫原性的糖蛋白能夠讓疫苗激發(fā)機體免疫反應(yīng)，保護機體預(yù)防傳染病。貓皰疹病毒1型基因組編碼多種蛋白質(zhì)，已報道了17種病毒特異性蛋白和3種具有免疫原性的糖蛋白[8]。貓皰疹病毒Ⅰ型中的gB、gC、gD、gE、gG、gH和gL這7種糖蛋白已得到鑒定，病毒在識別、侵入、感染、在細胞間傳播和感染釋放過程中這些糖蛋白都發(fā)揮著重要作用。gD蛋白具有血凝特性，能產(chǎn)生血凝與血凝抑制作用。Ken M等[9]發(fā)現(xiàn)表達貓皰疹病毒Ⅰ型gD蛋白的昆蟲細胞可吸附貓的細胞，但不吸附牛、豬和犬的細胞，而且這種吸附可以被相對應(yīng)的單克隆抗體抑制，此外，貓皰疹病毒Ⅰ型gD蛋白和犬皰疹病毒gD蛋白只能凝集各自宿主的紅細胞，由此推測，這表明gD蛋白在病毒感染的宿主細胞選擇上具有特異性，或者這也正說明為何虎在使用貓的商品化疫苗不能預(yù)防傳染性鼻氣管炎。gD糖蛋白也被認為是病毒粒子表面和病毒感染細胞所必需的主要蛋白，抗此糖蛋白的單克隆抗體在病毒吸附后中和病毒，并顯示出較高的中和效價，表明gD蛋白可能參與病毒進入細胞，并為病毒復(fù)制的必需蛋白。Limcumpao J P等[10]用鼠和牛的免疫試驗顯示，gD能夠引起比gB、gC更強而持久的細胞免疫并用親和層析的方法從貓皰疹病毒Ⅰ型中純化出gD蛋白，用該蛋白免疫小鼠，可使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生病毒中和抗體；Spatz Stephen J等[11]利用重組的FHV－1gD蛋白基因的疫苗病毒免疫家兔，也能產(chǎn)生高滴度的病毒中和抗體。綜上gD蛋白在免疫上的優(yōu)勢，在研制針對虎源傳染性鼻氣管炎的疫苗上，應(yīng)選擇gD蛋白作為主要特異性抗原。

除抗原外，同時在選擇DNA疫苗的表達載體研制上，必需考慮到其高效性與安全性：① 要制備大量的外源基因，也就是質(zhì)粒載體必須是能在大腸埃希菌中高拷貝的擴增；② 外源基因?qū)爰毎槐唤到猓虎?外源基因在動物細胞內(nèi)能夠高效表達，但不復(fù)制，其表達抗原蛋白的能力越強，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答也越強。同時表達載體必須不含有向宿主細胞基因組內(nèi)整合的序列以保證其使用安全性[12－16]?；谝陨系囊罂紤]，本研究選取了真核表達載體pcDNA3.1（＋）作為表達載體，它的啟動子是真核細胞中具有較大活性的人巨細胞病毒（CMV）直接早期區(qū)，CMV強啟動子對大多數(shù)DNA疫苗具有很強的調(diào)節(jié)功能，當(dāng)表達的抗原基因位于CMV強啟動子后就能夠持續(xù)大量得到表達[17]，試驗中pcDNA3.1（＋）不僅在DH5α大腸埃希菌中高效拷貝擴增，并且在轉(zhuǎn)染293T細胞后能夠高效大量的表達出目的蛋白，這些都足以證明pcDNA3.1（＋）作為DNA疫苗的優(yōu)勢。此外，pcDNA3.1（＋）載體還含有Amp基因，Amp基因內(nèi)部的CpG基元（非甲基化脫氧核苷酸片段），能夠增強機體的免疫應(yīng)答[18]。

試驗中通過構(gòu)建真核表達載體pcDNA－gD成功在真核細胞中表達出虎源皰疹病毒Ⅰ型gD蛋白，為下一步進行小鼠DNA疫苗免疫試驗研究奠定了基礎(chǔ)。

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