何世成，王昌建，邱立新，王衛(wèi)國，唐小明，魯杏華，林 源，范仲鑫，朱春霞，劉道新

（湖南省動物疫病預防控制中心，湖南長沙410014）

高致病性禽流感（HPAI）是養(yǎng)禽業(yè)的頭號殺手，也是具有重要公共衛(wèi)生意義的人獸共患?。?－3］。目前，我國引起HPAI的病原主要為H5亞型禽流感病毒［1－2］。我國對HPAI的防控采取免疫與撲殺相結合的綜合措施［3－4］，高免疫壓力可使 HPAI流行毒株基因變異速度加快［5－7］。為確保免疫效果，我國農(nóng)業(yè)部屢次更換HPAI疫苗種毒株，2012年6月，我國農(nóng)業(yè)部在全國范圍內(nèi)將高致病性禽流感疫苗生產(chǎn)種毒Re－5株更換為Re－6株。為掌握重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re－6株）免疫鴨的臨床效果，本試驗選擇市場上流通的6家企業(yè)生產(chǎn)的重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re－6株）對農(nóng)村散養(yǎng)鴨進行了臨床免疫效果研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 A、B、C、D、E、F等6個企業(yè)生產(chǎn)的重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re－6株），試驗用疫苗隨機取自湖南省縣級疫苗儲備庫，且均在使用有效期內(nèi)。

1.1.2 試驗用動物及場地 漢壽縣洋淘湖鎮(zhèn)李發(fā)財?shù)傍唸?，該場場主具?0年以上蛋鴨飼養(yǎng)經(jīng)驗，場內(nèi)有近20畝水面，有良好的飼養(yǎng)棚具和優(yōu)良的防疫條件。試驗用同批次鴨為1 000羽，試驗期間不同群飼養(yǎng)其他鴨。

1.1.3 檢測試劑 禽流感病毒 H5（Re－6）血凝抑制試驗抗原（批號2013002）與陽性血清（批號2013001），哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司產(chǎn)品；禽流感病毒H5亞型熒光RT－PCR檢測試劑，中山大學達安基因股份有限公司產(chǎn)品（批號：2013001）。

1.2 方法

1.2.1 免疫試驗 用6個廠家生產(chǎn)的疫苗同時進行25日齡鴨免疫試驗。試驗分7組，其中，6個試驗組（以A、B、C、D、E、F為組別標識）分別用6個廠家生產(chǎn)的疫苗免疫，每組130羽，其余220羽為空白對照組（Blank），各試驗組用塑料小標簽作為腳標進行區(qū)別。免疫前，隨機采集試驗鴨血清、咽拭子和泄殖腔拭子各30份，疫苗組每羽頸后皮下注射對應廠家生產(chǎn)的疫苗0.5mL，空白對照組不免疫；從免疫接種后開始，連續(xù)7d，對試驗鴨進行臨床觀察并記錄；分別于免疫接種后14、22、29、48、77、105、133、165d進行采樣，每組隨機采集血清、咽拭子和泄殖腔拭子各20份。

1.2.2 實驗室檢測 應用 HA－HI試驗［8］檢測血清中的 H5AIV（Re－6）抗體，結果依據(jù)《2013年國家動物疫病監(jiān)測與流行病學調(diào)查計劃》（農(nóng)醫(yī)發(fā)［2013］9號）判斷標準進行判斷，即抗體效價≥4log2判定為抗體合格，抗體合格的樣品數(shù)占同組樣品總數(shù)的比率為合格率，合格率≥70%為群體免疫合格。應用禽流感病毒H5亞型熒光RT－PCR檢測試劑盒檢測咽拭子和泄殖腔拭子中的H5AIV核酸。

2 結果

2.1 臨床反應情況

試驗鴨免疫接種后連續(xù)觀察7d，均未出現(xiàn)免疫接種副反應，精神狀況良好，食欲及生長發(fā)育正常。

2.2 試驗鴨血清中 H5AIV（Re－6）抗體檢測結果

各組免疫接種前后血清 H5AIV（Re－6）HI抗體效價檢測結果見表1和圖1，合格率結果見表2和圖2，變異系數(shù)統(tǒng)計結果見表3和圖3、圖4。結果顯示，A組、B組、D組、E組、F組疫苗免疫接種后14d其平均抗體效價上升至合格效價標準（4log2）以上，并獲得70%以上的群體合格率，其中，B組、E組、F組抗體有效持續(xù)期（平均抗體效價≥4log2、群體合格率≥70%）在151d以上，A組抗體有效持續(xù)期稍短，為119d，D組在免疫接種后105d平均抗體效價下降至4log2以下，其抗體有效持續(xù)期僅為63d；C組疫苗免疫接種后22d其平均抗體效價上升至合格效價標準以上，并獲得70%以上的群體合格率，其有效持續(xù)時間達111d；6個試驗組各時間點抗體效價變異系數(shù)為0.14～0.93，平均變異系數(shù)為0.26～0.44，效價整齊度高。對各試驗組各時間點的平均抗體效價進行單因素方差分析，結果顯示，6組疫苗免疫組與空白對照組差異極顯著（P＜0.01）；D組與A組的免疫效果差異顯著（P＜0.05），與B組、E組、F組差異極顯著（P＜0.05）；C組與E組差異顯著（P＜0.05），與F組差異極顯著（P＜0.01）；F組與A組、B組差異顯著（P＜0.05）；其余試驗組間免疫效果差異不顯著（P＞0.05）。

表1 H5AIV（Re－6）抗體效價檢測結果Table 1 The detection results of antibody titer of H5AIV（Re－6）

表2 H5AIV（Re－6）抗體合格率結果Table 2 The results of qualified rate of H5AIV（Re－6）antibodies %

圖1 H5AIV（Re－6）抗體效價曲線圖Fig.1 The curve of H5AIV（Re－6）antibody titer

圖2 H5AIV（Re－6）抗體合格率曲線圖Fig.2 The curve of H5AIV（Re－6）antibody qualified rate

表3 H5AIV（Re－6）抗體效價變異系數(shù)Table 3 The variation coefficient of H5AIV（Re－6）antibody titers

圖3 免疫接種后不同時間點H5AIV（Re－6）抗體效價變異系數(shù)圖Fig.3 The variation coefficient of H5AIV（Re－6）antibody titers at different times

圖4 各試驗組 H5AIV（Re－6）抗體效價變異系數(shù)平均值柱形圖Fig.4 The mean variation coefficient of H5AIV（Re－6）antibody titers in the experimental groups

2.3 試驗動物拭子病原學檢測結果

試驗鴨免疫接種前后各時間點拭子樣品經(jīng)熒光RT－PCR檢測，H5亞型AIV核酸均為陰性。

3 討論

試驗結果顯示，重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re－6株）對農(nóng)村散養(yǎng)鴨具有良好的臨床安全性，可產(chǎn)生較好的免疫反應；不同企業(yè)生產(chǎn)的疫苗免疫效果存在差異，部分企業(yè)生產(chǎn)的疫苗之間差異顯著，且部分差異極顯著。

試驗結果顯示，重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re－6株）對農(nóng)村散養(yǎng)鴨疫苗免疫接種后產(chǎn)生有效免疫保護（平均抗體效價≥4log2、群體合格率≥70%）的時間在免后14d～22d，免疫保護持續(xù)期最長達151d以上。

變異系數(shù)常用于反映試驗數(shù)據(jù)離散程度。本次試驗的6組疫苗，誘導的抗體效價平均變異系數(shù)均在0.44以下，最低的僅為0.26，表明試驗疫苗的免疫效果受個體差異的影響很小，群體免疫的均一性良好。

禽流感滅活疫苗對水禽進行一次免疫接種的免疫效果歷來較差，抗體水平較低，抗體合格持續(xù)期短［9－13］。本次試驗所有試驗疫苗均進行一次免疫接種，除1組疫苗免疫效果較差外，其他組疫苗的免疫效果，在抗體產(chǎn)生速度和合格抗體持續(xù)時間上，均明顯優(yōu)于以往報道，其原因可能是疫苗用種毒株Re－6株對鴨的免疫原性優(yōu)于以往的疫苗毒株。

［1］ 楊彩然，董淑珍，楊宗澤，等.禽流感病毒致病性的分子基礎研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2010，31（6）：92－96.

［2］ 孫佳善，熊永忠，包紅梅，等.禽流感對食品安全的影響［J］.動物醫(yī)學進展，2012，33（5）：115－118.

［3］ Swayne D E，Spackman E.Current status and future needs in diagnostics and vaccines for high pathogenicity avian influenza［J］.Dev Biol（Basel），2013，135：79－94.

［4］ 劉志剛，劉立峰，陳倫勇，等.禽流感新型疫苗研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2013，34（2）：99－103.

［5］ Peng Y，Zou Y，Li H，et al.Inferring the antigenic epitopes for highly pathogenic avian influenza H5N1viruses［J］.Vaccine，2014，32（6）：671－676.

［6］ Sergeeva M V，Romanova I R.Vaccines against highly pathogenic influenza viruses of the avian origin［J］.Vopr Virusol，2013，58（4）：4－9.

［7］ Wu J，F(xiàn)ang H H，Chen J T，et al.Immunogenicity，safety，and cross－reactivity of an inactivated，adjuvanted，prototype pandemic influenza（H5N1）vaccine：aphase II，double－blind，randomized trial［J］.Clin Infect Dis，2009，48（8）：1087－1095.

［8］ 中華人民共和國國家標準GB18936－2003［S］.高致病性禽流感診斷技術.

［9］ 黃建龍，劉道新，邱立新，等.兩種禽流感H5N1亞型Re－5株滅活疫苗免疫效果的比較［J］.動物醫(yī)學進展，2011，32（1）：120－123.

［10］ Qiao C L，Yu K Z，Jiang Y P，et al.Protection of chickens against highly lethal H5N1and H7N1avian influenza viruses with a recombinant fowlpox virus co－expressing H5haemagglutinin and N1neuraminidase genes［J］.Avian Pathol，2003，32（1）：25－32.

［11］ Tian G，Zhang S，Li Y，et al.Protective efficacy in chickens，geese and ducks of an H5N1－inactivated vaccine developed by reverse genetics［J］.Virology，2005，341（1）：153－162.

［12］ 邱伯根，郭永祥，劉道新，等.三種禽流感滅活疫苗對農(nóng)村散養(yǎng)鴨的免疫效果比較［J］.中國家禽，2007（6）：17－19.

［13］ 沈欣悅，程 旭，劉 梅，等.重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型）對鴨和鵝的免疫效果觀察［J］.中國動物傳染病學報，2013（4）：40－45.